[发明专利]一种小牛血清中的5-羟色胺检测方法

说明书

本发明提供一种小牛血清中的5‑羟色胺含量的检测方法，所述方法包括：(1)小牛血清供试品溶液制备：将待测样品小牛血清进行离心超滤处理，即得小牛血清供试品溶液；(2)分别取5‑羟色胺盐酸盐对照品溶液、步骤(1)所得小牛血清供试品溶液，采用液相色谱法检测供试品溶液中5‑羟色胺的含量。本发明的方法能够准确分离和测定小牛血清中的5‑羟色胺含量，具有检测成本较低、快速、准确、灵敏度高的特点。

技术领域

本发明属于药用原料的分析检测应用领域，具体地涉及到一种小牛血清中的5-羟色胺含量的检测方法。

背景技术

5-羟色胺又名血清素，一种吲哚衍生物，分子式C₁₀H₁₂N₂O，分子量:176.22，英文名：5-hydroxytryptamine，简称5-HT，普遍存在于动植物组织中。最早是从血清中发现的，又名血清素，广泛存在于哺乳动物组织中，特别在大脑皮层质及神经突触内含量很高。它参与血压的调节；活化血小板，诱导血小板的聚集；刺激有丝分裂的发生；活化T、B淋巴细胞，自然杀伤细胞(NK)和吞噬细胞；参与中枢神经系统的神经传递，与其他神经递质一起，参与行为活动、情绪、食欲、体温调节等。因此测定血清中5-HT的含量，对有关疾病的判断显得十分必要。

小牛血清中的5-羟色胺含量测定国内外无相关检测文献报道，本专利主要开发一种准确、方便和有效的小牛血清中的5-羟色胺含量测定方法，检测小牛血清产品质量。

文献报道了不同的人血清中5-羟色胺的含量测定方法，主要有荧光分析法、酶联免疫法、高效液相色谱-荧光检测器柱前衍生化法、液相质谱法。荧光分析法、高效液相色谱-荧光检测器都需要显色反应，操作过程繁琐，无法准确直观定量被检测产品中5-羟色胺的含量；酶联免疫法，操作掌握复杂，难于精确定量，不适合含量微量的生物样品；质谱法特异性强，准确度高，但是费用昂贵，仪器操作复杂，常用于未知样品的定性，但是用于常规已知样品的日常检验，仪器检验成本相对较高，不利于企业进厂规模的检测。

黄建国等人发表的“高效液相色谱-紫外光检测法测定血清5-羟色胺”(《宁夏医学杂志》第2002年12月第24卷，第745～746页)中公开了一种新的高效液相色谱-紫外光检测法(HPLC-VD)测定正常人血清5-HT含量的方法。但是，该方法血清(样品、样本)处理较为复杂，使用三氯乙酸为蛋白沉淀剂处理，而三氯乙酸2017年被WHO列为2B类致癌物，有刺激性气味，对人体健康危害型较多；此外，方法主要用于临床科研检验，不能有效的用于药用原料小牛血清产品中5-羟色胺的检测。

李雪芹等人发表的“反相高效液相色谱-紫外光检测法测定血浆及血小板中5-羟色胺含量”(实用药物与临床2010年第13卷第2期，第119-121页)中公开了一种检测血浆及血小板中5-羟色胺含量的反相高效液相色谱-紫外光检测法。该方法血清由于(样品、样本)处理较为复杂，要求样本处理温度条件苛刻，并使用了抗凝剂和作为蛋白质沉淀剂的三氯乙酸，而三氯乙酸已经被列为2B类致癌物而不建议使用；方法可用于临床科研检验，不能有效的用于药用原料小牛血清产品中5-羟色胺的检测。

Qiangqiang He等人发表了“A simple,efficient and rapid HPLC–UV methodfor the detection of 5-HT in RIN-14B cell extract and cell culture medium”(BMC Chemistry,(2019)13:76，第1～9页)中公开了一种检测细胞提取物的5-HT含量方法的HPLC–UV方法，该方法下5-HT出峰时间较快，不适用于内源物质较多的产品检测，其不能将5-HT与其内源物质有效分离。

制药过程中小牛血清去蛋白制剂所用小牛血清原料的质量直接关系最终产品的质量，其中5-羟色胺在小牛血清中含量也直接关系到产品的质量。如何有效、快速检测小牛血清原料中5-羟色胺、且检测条件及处理方法能够直接对小牛血清中5-羟色胺进行定量检测，不需要进行复杂的前处理与较长时间的等待在制药过程中具有重要的意义。