[发明专利]抗体-转座酶融合蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种抗体‑转座酶融合蛋白及其制备方法和应用，抗体‑转座酶融合蛋白包括His蛋白、TEV蛋白、抗体蛋白和Tn5蛋白，His蛋白依次与TEV蛋白、抗体蛋白和Tn5蛋白通过linker蛋白进行融合连接。制备方法：将目的基因插入到载体质粒的克隆位点获得可用于蛋白表达的重组质粒；将重组质粒转化至感受态细胞中进行诱导表达。本发明中的抗体‑转座酶融合蛋白，在原位对靶蛋白进行识别，将Tn5锚定在靶蛋白处，同时与Tn5连接的adaptor上加有特定的barcode序列，实现与抗体的对应，从而同时标记多个靶蛋白，并可以彼此区分，可用于制备单细胞多蛋白位点的分析试剂盒。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种抗体-转座酶融合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

染色质免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)和染色质免疫沉淀结合高通量测序(Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing,ChIP-seq)是广泛使用的、经典的研究蛋白质-DNA互作的方法，距今已有20年的历史。传统ChIP的流程包括细胞交联、提取细胞核、裂解细胞核并超声破碎打断染色质、抗体免疫沉淀捕获蛋白-DNA复合物以及纯化DNA。利用该方法，可以研究转录因子、组蛋白及其它特定蛋白质与基因组DNA的相互作用，从而探索转录调控和胚胎发育的相关科学问题。然而传统ChIP存在以下缺陷：

首先，在传统的ChIP中需要使用甲醛对蛋白-DNA复合物进行交联，而且由于组织/细胞类型的不同，使用的甲醛浓度和固定时间都有差异。交联过轻或者过度，都会导致实验结果不理想，甚至失败。因此，针对不同的样品，需要花费大量时间优化交联条件，确保交联程度最佳以及批次间可重复性。同时甲醛是强致癌物，会危害实验人员的身体，并且造成环境污染。其次，在用超声进行染色质破碎时，随着组织/细胞的类型和数量、破碎时间、破碎强度、超声仪的品牌等条件的改变，超声后片段大小也会有较大差异，导致实验的可重复性差。同时，超声带有能量，会破坏染色质的结构，造成假阴性结果。此外，传统的ChIP方法还存在一个致命的缺陷，它需要的起始细胞数量为10⁶以上，这个数量的培养细胞或者一般成体组织细胞比较容易获得，但对于早期胚胎发育相关的细胞和组织则有极大制约，例如哺乳动物的卵子、受精卵、发育早期胚胎以及早期胚胎的心脏和神经组织等，此类组织或细胞取材困难，限制了ChIP在相关领域的应用和发展。此外，传统ChIP实验流程繁琐，实验周期较长，一个完整的实验需要2-3天的时间，存在过多的不可控因素。

近几年出现的CUTRUN、CUTTag以及CoBATCH等新方法极大降低了ChIP所需的实验时间和起始细胞数量。首先，使用ConA(刀豆凝集素，可以结合细胞膜或核膜的糖蛋白)beads捕获消化后的单细胞，对细胞进行通透化处理，之后向体系中加入目的蛋白的特异性抗体，然后利用微球菌核酸酶(MNase)或者转座酶(Tn5)与Protein A(能够识别结合抗体的IgG结构域)组成的融合蛋白，识别并捕获细胞内的抗体-靶蛋白复合物，使用Ca²⁺/Mg²⁺激活MNase或者Tn5，从而切割靶点处的DNA，最后纯化DNA并完成文库构建。相较于传统ChIP，这些方法在很大程度上简化了整个实验流程，缩短了实验时间、避免了机械的超声步骤、提高了实验的可重复性、降低了起始细胞量，并广泛适用于各种组织类型的细胞。

虽然这些方法较好的解决了传统ChIP-seq方法的部分不足，如材料要求和可重复性的问题，同时使得单细胞ChIP-seq成为了可能。但由于Protein A/G对于不同种属的抗体都具有一定的亲和能力，所以无法对一个细胞内的多个靶蛋白进行标记，只能通过一种组蛋白或转录因子的结合序列进行细胞分群，但如果能在同一个细胞中标记两个及以上的靶点，即可进一步划分细胞类群，获得更加清晰的细胞谱系，对于研究生物进化发育和转录调控具有重要意义。

发明内容