[发明专利]一种适用于酶解艾草叶片组织的酶解液、艾草叶片组织原生质体的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种适用于酶解艾草叶片组织的酶解液，所述酶解液包括酶解液A和YF缓冲液，所述酶解液A中含有2％(m/v)纤维素酶R‑10、0.4％(m/v)离析酶R‑10、0.1～1％(m/v)果胶酶、1～3％(m/v)半纤维素酶、0.45～0.55mol/L甘露醇、20mM MES、20mM KCl、10mM CaCl₂、0.1％(v/v)BSA，溶解于超纯水中；所述YF溶液中含有20mM MES、20mM KCl、0.1％(v/v)BSA、0.5mol/L甘露醇、1～3％(m/v)聚乙烯吡咯烷酮PVP‑40，溶于超纯水中。本发明还公开了上述酶解液在制备艾草叶片组织原生质体中的应用，所述制备方法包括配置酶解液、样本预处理、酶解、过滤、离心、洗涤原生质体沉淀、镜检原生质体活性。本发明还公开了上述制备方法制备获得的艾草叶片组织原生质体在单细胞转录组测序中的应用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种适用于酶解艾草叶片组织的酶解液、艾草叶片组织原生质体的制备方法及其应用。

背景技术

单细胞转录组测序是当前生命科学研究领域的尖端技术手段，已在众多动物组织中得到了广泛应用。但因为细胞壁的存在，目前植物组织进行单细胞转录组测序必须先将植物细胞解离为原生质体，如《Arabidopsis mesophyll protoplasts:aversatile cellsystem for transient gene expression analysis》一文，通过制备拟南芥叶片原生质体，开展植物单细胞转录组测序。

现有技术中对于模式植物拟南芥的原生质体酶解方法和相应的单细胞转录组测序研究比较多，虽然拟南芥和艾草同属于植物，其叶片组织在结构和功能上具有一定的相似性。然而，由于生存于不同的环境中，植物通常表现出截然不同的生长发育特性。艾草的生长环境与拟南芥相比非常不同，造成了艾草细胞与拟南芥细胞在生理生化、结构、功能等方面均具有非常大的差异，适用于拟南芥叶片酶解的步骤在艾草当中不能有效发挥功能，导致艾草叶片组织无法开展单细胞转录组测序研究，需要开发一种新的适用于单细胞转录组测序实验的酶解液和其操作流程。

发明内容

为了解决现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种适用于艾草叶片组织单细胞转录组测序中的样本解离的方法，及相应的酶解液配方和操作步骤。

本发明提供了一种适用于酶解艾草叶片的酶解液，所述酶解液包括酶解液A和YF缓冲液。

其中，所述酶解液A中含有2％(m/v)纤维素酶R-10、0.4％(m/v)离析酶R-10、0.1～1％(m/v) 果胶酶、1～3％(m/v)半纤维素酶、0.45～0.55mol/L甘露醇、20mM 2-(N-吗啉基)乙磺酸MES、 20mMKCl、10mM CaCl₂、0.1％(v/v)BSA，溶解于超纯水中。

优选地，所述果胶酶的终浓度为1％(m/v)；

优选地，所述半纤维素酶的终浓度为3％(m/v)；

优选地，所述甘露醇的终浓度为0.55mol/L。

其中，所述YF溶液中含有20mM 2-(N-吗啉基)乙磺酸MES、20mM KCl、0.1％(v/v)BSA、 0.5mol/L甘露醇、1～3％(m/v)聚乙烯吡咯烷酮PVP-40，溶于超纯水中。

优选地，所述聚乙烯吡咯烷酮PVP-40的终浓度为3％。

本发明所述YF缓冲液可以在洗涤原生质体的过程中，维持原生质体活性，且通过两遍洗涤仍有90％得率；其次，所述YF缓冲液还可以保护胞质内RNA不被影响。