[发明专利]一种适用于酶解艾草叶片组织的酶解液、艾草叶片组织原生质体的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种适用于酶解艾草叶片组织的酶解液，其特征在于，所述酶解液包括酶解液A和YF缓冲液。

2.如权利要求1所述的酶解液，其特征在于，所述酶解液A中含有2％(m/v)纤维素酶R-10、0.4％(m/v)离析酶R-10、0.1～1％(m/v)果胶酶、1～3％(m/v)半纤维素酶、0.45～0.55mol/L甘露醇、20mM 2-(N-吗啉基)乙磺酸MES、20mM KCl、10mM CaCl₂、0.1％(v/v)BSA，溶解于超纯水中。

3.如权利要求1所述的酶解液，其特征在于，所述YF溶液中含有20mM 2-(N-吗啉基)乙磺酸MES、20mM KCl、0.1％(v/v)BSA、0.5mol/L甘露醇、1～3％(m/v)聚乙烯吡咯烷酮PVP-40，溶于超纯水中。

4.一种艾草叶片组织原生质体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

步骤1、配置酶解液：分别配置酶解液A和YF缓冲液，并置于离心管中室温放置备用；

步骤2、样本预处理：将艾草叶片用无菌水冲洗后，切成细丝后放入盛有所述酶解液A的培养皿中；

步骤3、酶解：将装有酶解液A和组织的培养皿置于恒温混匀仪后酶解，避光消化，吸取酶解液镜检，计算酶解得到的原生质体总数；

步骤4、过滤：将所述步骤3中的消化液用组装在离心管上的细胞筛网过滤；

步骤5、离心：将过滤液用水平转子离心，富集原生质体，弃去部分上清液，重悬沉淀，镜检计算原生质体总数；

步骤6、洗涤原生质体沉淀：用室温的YF缓冲液富集原生质体1-2次，弃去上清液后，用YF缓冲液重悬原生质体，得到所述的艾草叶片组织原生质体。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述室温为20～25℃；

和/或，所述酶解液A中含有2％(m/v)纤维素酶R-10、0.4％(m/v)离析酶R-10、0.1～1％(m/v)果胶酶、1～3％(m/v)半纤维素酶、0.45～0.55mol/L甘露醇、20mM 2-(N-吗啉基)乙磺酸MES、20mM KCl、10mM CaCl₂、0.1％(v/v)BSA，溶解于超纯水中；

和/或，所述YF溶液中含有20mM MES、20mM KCl、0.1％(v/v)BSA、0.5mol/L甘露醇、1～3％(m/v)聚乙烯吡咯烷酮PVP-40，溶于超纯水中。

6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述无菌水的冲洗次数为3-5次；和/或，所述细丝的尺寸为0.5-1mm；和/或，每5mL酶解液A对应组织鲜重0.5±0.01g。

7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤3中，所述酶解的温度为30～37℃；和/或，所述酶解的转速为200～300rpm；和/或，所述酶解的时间为3-4h。

8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤4中，所述细胞筛网的孔径为40μm；所述离心的转速为660-740rpm；所述离心的温度为18～25℃；所述离心的时间为6-7min。

9.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤5中，所述离心的转速为660-740rpm；所述离心的温度为18～25℃；所述离心的时间为6-7min；所述镜检操作使用质量分数0.4％的台盼蓝进行，并将台盼蓝溶液与解离液按体积比为1：9混匀。

10.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤6中，用于重悬原生质体的YF缓冲液的体积为300-500μL。

11.一种通过如权利要求4-10之任一项所述方法制备获得的艾草叶片组织原生质体。

12.如权利要求1所述的酶解液、或如权利要求11所述的艾草叶片组织原生质体在单细胞转录组测序中的应用。