[发明专利]一种基于唾液特异性岩藻糖基化结构糖谱及其检测方法和应用

权利要求书

1.一种基于唾液特异性岩藻糖基化结构糖谱，其特征在于，包括如下通式结构：

其中，

F为岩藻糖；

G为半乳糖；

M为甘露糖；

N为乙酰氨基葡糖；

α1,2代表G单糖的碳2与F单糖的碳1连接；

α1,3代表N单糖的碳3与F单糖的碳1连接；

α1,6代表N单糖的碳6与F单糖的碳1连接。

2.一种基于唾液特异性岩藻糖基化结构糖谱的检测方法，其特征在于，包括步骤：

1)从蛋白质中提取聚糖；

2)确定聚糖岩藻糖链接的方法；

3)唾液特异性岩藻糖基化结构糖谱的检测。

3.根据权利要求2所述的一种基于唾液特异性岩藻糖基化结构糖谱的检测方法，其特征在于：步骤1)中，所述从蛋白质中提取聚糖包括：

(1)填充移液管制备：

将微米级多孔筛板加入空心移液管；

将表面修饰有醛基的纳米级多孔微米球形树脂填充到空心移液管，填充后空心移液管称为填充移液管；

将另一个微米级多孔筛板加入至所述填充移液管中，将醛基树脂固定于所述填充移液管中；

(2)蛋白固相结合

将蛋白质溶于去离子水中，用塑料离心管存放溶解后的蛋白质；

将所述溶解后的蛋白质加热变性，冷却至室温后加入二硫苏糖醇还原，最后加入碘乙酰胺将蛋白质烷基化，获得样本；

通过洗脱和离心将反应缓冲液替换为PBS，同时加入氰硼氢化钠室温反应，将蛋白与固相形成的-C＝N-还原成-C-N-共价键；

将所述填充移液管上的样本清洗；

(3)N-聚糖制备

在所述填充移液管中加入N-糖苷酶，使用碳酸氢铵缓冲溶液，将N-聚糖从所述填充移液管树脂上固定的蛋白质酶解至碳酸氢铵缓冲溶液中；

通过离心收集上清液，再加入稀释乙腈洗脱填充移液管树脂，并收集上清液，重复此步骤一次；

将所有收集的上清液合并，取其中部分用质谱仪器分析聚糖成分和丰度。

4.根据权利要求3所述的一种基于唾液特异性岩藻糖基化结构糖谱的检测方法，其特征在于，在步骤(2)中所述通过洗脱和离心将反应缓冲液替换为PBS，同时加入氰硼氢化钠室温反应，将蛋白与固相形成的-C＝N-还原成-C-N-共价键之前还包括：调节样本pH值至10，加入柠檬酸钠和醋酸钠配制的缓冲液，反应使蛋白质N-端和/或赖氨酸与固相树脂上的醛基反应结合；再加入氰硼氢化钠到所述样本中反应，将-C＝N-还原形成-C-N-共价键。

5.根据权利要求3所述的一种基于唾液特异性岩藻糖基化结构糖谱的检测方法，其特征在于，在步骤(3)之前还包括确定α1,2岩藻糖、α1,3岩藻糖和α1,6岩藻糖中的任意一种或多种。

6.根据权利要求5所述的一种基于唾液特异性岩藻糖基化结构糖谱的检测方法，其特征在于，所述确定α1,2岩藻糖包括：加入α1-2岩藻糖苷酶到所述填充移液管树脂固相中，将α1,2岩藻糖酶解；通过所述酶解反应，将α1,2岩藻糖从聚糖上酶切，所得聚糖分子量如果相差一个岩藻糖，则推断含有一个α1,2岩藻糖，如果相差两个岩藻糖分子量，则推断含有两个α1,2岩藻糖，以此类推；如果α1-2岩藻糖苷酶酶切后聚糖仍含有岩藻糖，则推断该聚糖可含有α1,3岩藻糖和/或核心α1,6岩藻糖。

7.根据权利要求5所述的一种基于唾液特异性岩藻糖基化结构糖谱的检测方法，其特征在于，所述确定α1,3岩藻糖包括：在所述填充移液管树脂固相中加入α1-2,3,4岩藻糖苷酶，将α1,3岩藻糖酶解；通过所述酶解反应将α1,3岩藻糖从聚糖上酶切，所得聚糖分子量如果相差一个岩藻糖，则推断含有一个α1,3岩藻糖，如果相差两个岩藻糖分子量，则推断含有两个α1,3岩藻糖，以此类推；如果α1-2,3,4岩藻糖苷酶酶切后聚糖仍含有岩藻糖，则推断该聚糖可能为核心α1,6岩藻糖。