[发明专利]一种多维液相色谱联用质谱检测牛奶中肠毒素C的方法

权利要求书

1.一种多维液相色谱联用质谱检测牛奶中肠毒素C的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S1：选择二维分离模式，搭建二维液相色谱平台，包括第一维离子交换液相色谱和第二维反相液相色谱；

步骤S2：牛奶通过所述二维液相色谱平台分离得到馏分，所述馏分完整蛋白的质谱鉴定和酶解肽质谱鉴定，鉴定肠毒素C。

2.根据权利要求1所述的多维液相色谱联用质谱检测牛奶中肠毒素C的方法，其特征在于，第一维离子交换液相色谱中，色谱柱为阳离子交换色谱柱。

3.根据权利要求1所述的多维液相色谱联用质谱检测牛奶中肠毒素C的方法，其特征在于，第一维离子交换液相色谱中，流动相pH为4.5～5.5。

4.根据权利要求1所述的多维液相色谱联用质谱检测牛奶中肠毒素C的方法，其特征在于，第一维离子交换液相色谱中，肠毒素C在第一维色谱柱的洗脱位置为35～40min。

5.根据权利要求1所述的多维液相色谱联用质谱检测牛奶中肠毒素C的方法，其特征在于，第一维离子交换液相色谱中，洗脱条件为：

流动相：A相：20mM K2HPO4(pH＝5.3)+10％ACN；B相：20mM K2HPO4(pH＝5.3)+10％ACN+1M NaCl；

洗脱条件：0～10min 0％B相，20～30min 8％～9％B相，30.1～50min 25％～26％B相，70～100min 100％B相，100～120min 0％B相；

流速：1mL/min；

检测波长：215nm。

6.根据权利要求1所述的多维液相色谱联用质谱检测牛奶中肠毒素C的方法，其特征在于，第二维反相液相色谱中，色谱柱为C8色谱柱。

7.根据权利要求1所述的多维液相色谱联用质谱检测牛奶中肠毒素C的方法，其特征在于，第二维反相液相色谱中，肠毒素C在第二维色谱柱的洗脱位置为24～26min。

8.根据权利要求1所述的多维液相色谱联用质谱检测牛奶中肠毒素C的方法，其特征在于，第二维反相液相色谱中，洗脱条件为：

流动相：A相：乙腈-水(5％+95％，0.1％TFA)；B相：乙腈(0.1％TFA)；

洗脱条件：0～2min 5％B相，5～60min 33％～38％B相，60.1～90min 95％B相，90～120min 0％B相；

流速：0.2mL/min；

检测波长：215nm。

9.根据权利要求1所述的多维液相色谱联用质谱检测牛奶中肠毒素C的方法，其特征在于，二维分离得到的馏分进行完整蛋白的质谱鉴定的具体步骤为：

二维分离得到的馏分冻干后重悬于10μL纯水中，吸取2μL等比例加入2％TFA溶液、2,5-二羟基苯乙酮(DHAP)基质溶液，反复吹打至出现沉淀结晶，吸取2μL点于MALDI靶板上，自然风干后进行质谱图谱采集，依据分子量可初步鉴定是否为肠毒素C。

10.根据权利要求1所述的多维液相色谱联用质谱检测牛奶中肠毒素C的方法，其特征在于，二维分离得到的馏分进行完整蛋白的质谱鉴定的具体步骤为：

将二维分离得到的馏分进行酶解处理，经除盐后的样品吸取1μL点于MALDI靶板上，自然风干后再加入1μL基质溶液α-氰基-4-羟基肉桂酸共结晶，自然风干进行质谱图谱采集，经MASCOT数据库匹配，选择蛋白酶为胰蛋白酶，质量容忍值为100ppm，最多2个缺少裂解位点，选择烷基化修饰，最后根据匹配分值以及肠毒素的特征肽段鉴定肠毒素C。