[发明专利]一种视网膜前体细胞的筛选和培养方法

说明书

本发明涉及一种视网膜前体细胞的筛选和培养方法，属于生物技术领域。本发明的筛选方法通过改良TrypLE消化液以及直接贴壁培养后再分选，提高了细胞活性，降低细胞死亡率，分选活性率由40‑60％提高到95％以上。分选出的细胞在改良N2B27神经干细胞培养基中细胞扩增更加稳定，提高了扩增代次，由原来P5能稳定提高到P10左右，并保持着视网膜干细胞活性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种视网膜前体细胞的筛选和培养方法。

背景技术

视网膜变性疾病(RD)是以视网膜色素上皮细胞和视网膜神经元丢失为特点的一类严重致盲性眼病。针对视网膜变性导致的神经元死亡目前尚无有效的治疗手段，干细胞移植是治疗视网膜变性具有前景的治疗策略。

视网膜前体细胞(RPC)是一类有治疗潜力的干细胞。以往富集人视网膜前体细胞多从流产胚胎视网膜，来源受限，并涉及伦理学问题，因此迫切需要开发新的治疗细胞来源。人视网膜类器官是经人多能干细胞诱导形成的三维视网膜组织，与在体视网膜发育高度相似，并且其突破伦理学限制，在体外较易获得，有望成为干细胞治疗视网膜变性新的种子细胞来源。积极开发从人视网膜类器官上稳定高效富集治疗细胞的策略将为治疗视网膜变性疾病提供丰富的治疗来源，是干细胞治疗视网膜变性疾病临床转化的必经之路。

前期已经证实通过表面抗原分选C-kit⁺SSEA4^-细胞是一群具有治疗效果的视网膜前体细胞。目前从类器官中富集这群视网膜前体细胞采取机械分离加消化酶分离单细胞---表面抗体染色---过细胞筛网---上机分选---阳性细胞接种(整个过程需要3-4小时左右)，主要存在以下问题：1、视网膜类器官神经组织消化较困难，分离的细胞活力低；2、消化后即时分选的单细胞总量少，富集到的阳性细胞数量少；3、从消化经过染色再分选耗时较长，最终分选得到的阳性细胞状态差，进而导致扩增困难。因此，有必要优化实验方案来获得更多数量和更高质量的C-kit⁺SSEA4^-视网膜前体细胞来满足临床移植治疗。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种视网膜前体细胞的筛选和培养方法。为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种视网膜前体细胞的筛选和培养方法，所述方法为：

(1)取视网膜类器官并分离视网膜神经层，将视网膜神经层放入改良消化液中37℃消化30分钟，在消化15分钟后将未消化散的神经层更换另一管新鲜改良消化液，摇晃、轻轻吹打，贴壁培养2天；

(2)取出步骤(1)中贴壁培养细胞，只加入TrypLE消化酶3-5分钟，收集细胞；

(3)将步骤(2)中收集的细胞用改良N2B27神经干细胞培养基培养。

作为优选的技术方案之一，所述改良消化液为TrypLE消化酶中含有0.125％胰蛋白酶。

作为优选的技术方案之一，所述改良N2B27神经干细胞培养基包括D/F12D/F12基础培养基、Neurobasal培养基、B27添加剂、N2添加剂、BFGF和血清替代物。

作为优选的技术方案之一，所述D/F12D/F12基础培养基和Neurobasal培养基的体积比为1：1。

作为优选的技术方案之一，所述B27添加剂的质量分数为2％、N2添加剂的质量分数为1％。

作为优选的技术方案之一，所述改良N2B27神经干细胞培养基中BFGF的终浓度为20ng/mL。

作为优选的技术方案之一，血清替代物的质量分数为3％。

本发明的有益效果在于：