[发明专利]一种衍生化-串联液质联用测定还原糖含量的方法

说明书

本发明提供一种衍生化‑串联液质联用测定还原糖含量的方法，以二苄胺为衍生化试剂进行如下步骤：(1)标准曲线的绘制；(2)还原糖含量的测定。本发明利用二苄胺与还原糖发生衍生化反应，在正离子模式下可检测到衍生化产物。而且二苄胺中所带氮元素，很容易地在正ESI模式下质子化，显著提高了还原糖在ESI模式下的离子化效率。本发明通过还原糖和衍生化试剂进行衍生反应，并对衍生产物进行测量，具有反应衍生化效率高、操作简便、重现性好的优势；本发明通过液相色谱串联质谱进行检测，具有灵敏度高，专属性强，测定时间短的特点；本发明有效地解决了还原糖因结构中缺乏易离子化的基团低限值难以检测的问题。

技术领域

本发明涉及还原糖测定技术领域，具体涉及一种衍生化-串联液质联用测定还原糖含量的方法。

背景技术

糖类化合物存在于所有的生物体中，主要用作能量来源，结构物质和功能性物质，在各种生物过程中起着关键的作用。糖类物质在诸多生命过程，如受精、生长、分化、发育、信号转导和免疫应答等方面起着重要的作用。建立高通量的定性定量检测糖的方法，有利于深入理解糖的生物学功能。

随着液质联用技术的广泛应用，液相色谱结合常用的电喷雾电离方式被广泛应用于糖类化合物的检测。但是由于糖类物质在常见的电喷雾离子源条件下电离化效率差，难以实现对于低浓度含量还原糖化合物的检测，这在很大程度上限制了液质联用技术对该类物质的灵敏分析。

为提高糖类物质的电离化效率，在质谱检测前通常需对其进行衍生化处理。目前常用的衍生化方法主要有还原端羟基的甲基化、乙酰化反应，该类反应针对羟基进行衍生，反应时间长，且难以保证羟基全部反应；吡唑啉酮衍生化，还原胺化反应，以及肼、酰肼与还原糖衍生化成腙反应，这三类反应针对还原端半缩醛进行衍生，但衍生后需进行除盐和样品的纯化等步骤，过程繁琐，易造成样品的损失。因此，开发探索新的衍生化策略，对实现低浓度还原糖的高灵敏度定性定量检测具有重要的价值。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种衍生化-串联液质联用测定还原糖含量的方法，包括如下步骤：

(1)标准曲线的绘制：配制不同还原糖含量的标准溶液，氮气吹干，加入二苄胺(衍生化试剂)和稀释剂，进行衍生化反应，得到衍生产物标准溶液，通过串联液质联用检测，得到衍生产物离子信号的色谱峰面积值和还原糖含量的标准曲线；

(2)还原糖含量的测定：将样品氮气吹干，加入二苄胺(衍生化试剂)和稀释剂，进行衍生化反应，得到衍生产物样品溶液，通过串联液质联用检测，得到样品中还原糖含量。

作为本发明一种优选的技术方案，所述还原糖选自葡萄糖及其衍生物、核糖及其衍生物、半乳糖及其衍生物、木糖及其衍生物、阿拉伯糖及其衍生物、甘露糖及其衍生物、麦芽糖及其衍生物和麦芽三糖及其衍生物、1-甲基-3-吡喃葡萄糖及其衍生物中的一种或几种。

作为本发明一种优选的技术方案，所述步骤(1)中，还原糖和二苄胺的摩尔比为1：(0.5～100)。

作为本发明一种优选的技术方案，所述稀释剂包括:有机溶剂、酸和水，加入稀释剂后，所述二苄胺的浓度为0.5～50mmol/L。

作为本发明一种优选的技术方案，所述稀释剂中的酸选自甲酸、乙酸、盐酸、硫酸和磺酸中的一种或多种；更进一步地，所述酸溶液中的酸选自甲酸和乙酸中的至少一种。

作为本发明一种优选的技术方案，所述稀释剂中的有机溶剂选自乙腈、乙醇、甲醇、异丙醇、丁醇和乙二醇中的一种或几种。

作为本发明一种优选的技术方案，所述稀释剂中酸的体积百分数为0.01～20％。

作为本发明一种优选的技术方案，所述稀释剂中水的体积百分数为0.01～20％。

作为本发明一种优选的技术方案，所述步骤(1)和步骤(2)反应的衍生化反应温度和时间相同，所述反应的温度为60～80℃，反应的时间为0.5～5h。