[发明专利]一种谷氨酸棒状杆菌发酵生产PHB的方法

说明书

本发明公开一种谷氨酸棒状杆菌发酵生产PHB的方法。所述方法包括在发酵过程中通过补料控制发酵培养基中碳氮摩尔比为(17～53):1，优选为(20～28):1。本发明通过调节发酵培养基中碳氮比影响谷氨酸棒状杆菌生产PHB的发酵过程，从而提高PHB的发酵产量。

技术领域

本发明属于生物发酵领域，具体涉及一种谷氨酸棒状杆菌发酵生产PHB的方法。

背景技术

聚羟基烷酸酯(PHAs)是一类由微生物全合成的高分子聚酯，这种聚合材料具有与石油基聚丙烯材料相当的热化学性能和物理强度，并且具有很好的生物相容性和生物可降解性，因此具有潜力替代传统的石油基塑料，减轻传统石油基塑料给环境带来的“白色污染”问题。PHA根据组成单体类别和聚合度的不同会有不同的材料性质，其中最简单的PHA是由单一的3-羟基丁酰辅酶A为单体聚合而成的聚3-羟基丁酸酯，简称PHB。

PHB是部分微生物在碳源丰富的条件下合成的，用于储存能量的物质，类似于哺乳动物合成的糖原。

传统的PHB生产菌株，如伯克氏菌，恶臭假单胞菌，嗜盐菌，真氧产碱杆菌以及通过代谢工程改造的大肠杆菌多属于革兰氏阴性菌，由于革兰氏阴性菌合成大量的免疫原性脂多糖，可能会污染利用PHB生产的医疗用品或食品，因此PHB通常通过革兰氏阳性菌产生。谷氨酸棒状杆菌作为一株通过美国食品安全局认证的GRAS菌株，生产的产品具有很好的安全性，不含内毒素，节省了下游的加工成本，因此可以作为良好的生产菌株。

谷氨酸棒状杆菌不是一个天然PHB生产菌株，近年来有一些研究在谷氨酸棒状杆菌中通过质粒表达PHB合成相关基因使其具备利用葡萄糖或淀粉合成PHB的能力，但由于通过质粒表达phbCAB基因的方式导致遗传不稳定性，也限制后续对于提高PHB产量的改造策略。通过基因整合的方式可将PHB合成的三个关键基因分步整合至谷氨酸棒状杆菌基因组上，使其获得稳定生产PHB的能力，获得改造菌株谷氨酸棒状杆菌。

为了提升谷氨酸棒状杆菌的PHB生产能力，本发明提供了一种通过调整谷氨酸棒状杆菌发酵过程中发酵液的组分提高谷氨酸棒状杆菌产PHB能力的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种谷氨酸棒状杆菌发酵生产PHB(聚3-羟基丁酸酯)的方法。

所述方法包括：在发酵过程中通过补料控制发酵培养基中碳氮比为(17～53):1，所述比例为摩尔比。优选地，碳氮比控制为(20～28):1，更优选为(23～24):1。

根据本发明的一些实施方式，通过调控谷氨酸棒状杆菌发酵过程中发酵液的C/N比，提高PHB的产量。当C/N比在上述范围内时，具有更高的PHB的产量。

发明人研究发现，当氮源并不是全部添加在初始培养基中，而是通过用氨水调节pH和/或发酵过程中补料硫酸铵的方式将氮源逐步添加至培养基中，能够保持菌体处于均衡的碳氮比条件下，并使发酵始终维持在合适的碳氮比条件下。

根据本发明的一些实施方式，发酵培养基的接种量为5％～15％(v/v)，优选为8％～12％(v/v)，优选为9％～11％(v/v)。发酵过程中发酵温度为20～40℃，优选为25～35℃，优选为29～31℃。搅拌速度为400～800rpm，优选为500～700rpm，优选为580～620rpm。通气量为0.3～3.0vvm，优选为0.5～1.8vvm，优选为1.3～1.5vvm。

根据本发明的一些实施方式，发酵培养基中起始的碳氮比(即初始发酵培养基的碳氮比)为(3～20):1，优选为(5～15):1，优选为(8～9):1，所述比例为摩尔比。

根据本发明的一些实施方式，发酵培养基的组分包括：80～160g/L葡萄糖、10～25g/L硫酸铵、0.1～0.5g/L硫酸镁、0.05～0.25mg/L维生素B7。

根据本发明的一些实施方式，所述发酵培养基选自CGXⅡ培养基、LBG培养基。