[发明专利]一种检测灵芝属真菌中性三萜的方法

权利要求书

1.一种检测灵芝属真菌中性三萜的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

(1)灵芝子实体的预处理步骤：将灵芝子实体样品加入有机溶剂进行提取，

取上清液，过滤，稀释，得到待测样品溶液；配制12个中性三萜化合物的混合标准品溶液；

(2)超高效液相色谱检测步骤：对待测样品溶液和12个三萜化合物的混合标准品溶液进行超高效液相色谱分离，以获得较好的分离度；

(3)化合物质谱信息获得步骤：利用质谱优化软件Agilent Optimizer，对12个中性三萜化合物进行母离子扫描、子离子对的检出以及最佳碰撞能的寻找；

(4)超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用分析方法建立步骤：在数据采集软件Agilent MassHunter Data Acquisition中，在超高效液相色谱分析条件和三重四级杆质谱检测条件下，导入保留时间，母离子、子离子对，建立12个中性三萜化合物的动态多反应监测DMRM分析测定方法；同时，

对不同浓度的混合标准品溶液和待测样品溶液进行上样测定；

(5)数据分析步骤：运用定量分析软件Agilent MassHunter Quantitative

Analysis，创建12个中性三萜化合物的标准曲线，对所建方法进行方法学验证，并对灵芝子实体待测样品溶液进行定量分析；

其中步骤(2)中超高效液相色谱分离的色谱条件为：选用Agilent ZORBAX SB-Aq色谱柱，1.8μm，2.1×150mm，检测波长：240nm；柱温：35℃；上样量为2μL；流速：0.4mL/min；流动相：A为0.01％醋酸水，B为甲醇；洗脱程序：0min，20％A，80％B；8min，20％A，80％B；10min，10％A，90％B；15min，0％A，100％B；18min，0％A，100％B；

其中步骤(4)中，以超高效液相色谱—三重四级杆质谱联用为分析检测仪器，其中超高效液相条件为：色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq色谱柱，1.8μm，2.1×150mm；检测波长：240nm；柱温：35℃；上样量为2μL；流速：0.4mL/min；流动相：A为0.01％醋酸水，B为甲醇；洗脱程序：0min，20％A，80％B；8min，20％A，80％B；10min，10％A，90％B；15min，0％A，100％B；18min，0％A，100％B；

其中质谱条件为：大气压化学电离源APCI作为离子源，检测在正离子模式下进行，选用动态多反应监测DMRM，毛细管电压3500V；毛细管出口电压：380V；电晕针电流：8μA；干燥气温度290℃；干燥气流量13L/min；气化室温度：350℃；雾化气压力：30psi；

其中12个三萜化合物为：

化合物1：Ganodermanontriol，化合物2：23S-hydroxy-11,15-dioxo-ganoderic acidDM，化合物3：7-Oxo-ganoderic acid Z，化合物4：Ganoderiol F，化合物5：Ganodermanondiol，化合物6：Lucialdehyde B，化合物7：Lucidal，化合物8：Ganoderol B，化合物9：Ganoderol A，化合物10：Lucialdehyde A，化合物11：Ganoderal A，化合物12：Ganoderiol A。

2.根据权利要求1所述的检测灵芝属真菌中性三萜的方法，其中步骤(1)中灵芝子实体的预处理步骤中：

所用有机溶剂为甲醇或乙醇中的一种；

提取方法为超声提取或60℃加热提取；

提取时间为10-90min；

料液比为1:20--1:40，重量体积比，重量g：体积ml；

取提取上清液用0.20μm孔径的有机相微孔滤膜过滤,然后用质谱级甲醇稀释20倍即获得进样用待测样品溶液。

3.根据权利要求1所述的检测灵芝属真菌中性三萜的方法，其中通过质谱优化软件Agilent Optimizer，获得步骤(3)中分析所需的各化合物的保留时间、母离子、子离子对及碰撞能信息如下：

Ganodermanontriol，保留时间：3.79min；母离子：455.0；定量离子：105.1，碰撞能：80；定性离子：107.0，碰撞能：37；

23S-hydroxy-11,15-dioxo-ganoderic acid DM，保留时间：3.98min；母离子：495.1；定量离子：435.3，碰撞能：17；定性离子：353.1，碰撞能：29；

7-Oxo-ganoderic acid Z，保留时间：4.34min；母离子：471.2；定量离子：107.1，碰撞能：61；定性离子：135.1，碰撞能：45；

Ganoderiol F，保留时间：5.94min；母离子：437.2；定量离子：67.2，碰撞能：73；定性离子：95.0，碰撞能：41；

Ganodermanondiol，保留时间：6.40min；母离子：439.2；定量离子：105.1，碰撞能：73；定性离子：109.1，碰撞能：41；

Lucialdehyde B，保留时间：6.79min；母离子：453.1；定量离子：327.1，碰撞能：17；定性离子：121.1，碰撞能：49；

Lucidal，保留时间：7.89min；母离子：437.1；定量离子：201.1，碰撞能：29；定性离子：119.1，碰撞能：37；

Ganoderol B，保留时间：10.80min；母离子：423.2；定量离子：67.0，碰撞能：61；定性离子：95.1，碰撞能：37；

Ganoderol A，保留时间：11.25min；母离子：421.1；定量离子：67.1，碰撞能：61；定性离子：95.0，碰撞能：45；

Lucialdehyde A，保留时间：11.25min；母离子：421.1；定量离子：109.1，碰撞能：29；定性离子：69.1，碰撞能：45；

Ganoderal A，保留时间：12.21min；母离子：437.0；定量离子：91.0，碰撞能：77；定性离子：81.0，碰撞能：49；

Ganoderiol A，保留时间：13.99min；母离子：475.0；定量离子：177.0，碰撞能：21；定性离子：145.1，碰撞能：53。