[发明专利]应用于红细胞超分辨成像及单分子追踪的综合分析方法

说明书

应用于红细胞超分辨成像及单分子追踪的综合分析方法，其属于活细胞超分辨成像及分析的技术领域。该方法利用微流控芯片对表面光滑的人类红细胞进行无创捕获，利用流体控制精准模拟生理微环境，结合先进的超分辨成像技术以及单分子追踪分析，在高时空精确度下，实现单个活细胞的超微结构成像及其膜表面动态分析。在单分子水平上，该方法提供精确、动态、多维度、高分辨率、单分子水平的生物成像表征，定量揭示人类红细胞变化的生物学机制，可适用于大规模的探究红细胞在刺激物作用下的响应规律，并为疾病提供早期预警信息。

技术领域

本发明涉及应用于红细胞超分辨成像及单分子追踪的综合分析方法，其属于活细胞超分辨成像及分析的技术领域。

背景技术

红细胞是人体血液中数量最多的一种细胞，承担运送氧气和二氧化碳的重要作用。传统的红细胞评价方法仅仅停留在对细胞群体平均值的评估，而且由于光学衍射极限的存在，无法对200nm以下的超微结构进行观测和动态分析，缺乏从分子层面上对红细胞的生理功能及状态可视定量化评价手段。一直以来，生物学家都企盼在不影响活细胞的固有属性前提下，在结构及分子层面实现活细胞的超高分辨率成像。近年来发展的超分辨荧光显微成像技术不仅实现纳米尺度分辨成像，而且保留了光学显微镜在生物成像方面的独有优势，比如活体、高速、低损伤、长时程、特异性荧光标记等等。利用超分辨成像，可以成功的实现活细胞的检测，并且突破常规光学衍射极限的限制，以更加直观、深入的方式认知复杂生命现象本质。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供应用于红细胞超分辨成像及单分子追踪的综合分析方法，将纳米尺度的超微结构信息和单分子尺度的瞬时动态信号共同作为红细胞生理状态的评判参考，这两种参数刻画了多种复杂生物分子复合体的时空分布及代谢机制。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案：应用于红细胞超分辨成像及单分子追踪的综合分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、样品的制备

采指尖血，加入等比例抗凝血剂及适宜浓度的细胞膜荧光染料染色，待染色完毕后，使用等渗溶液洗去多余染料，得到荧光染料标记的血红细胞样品。

S2、红细胞的固定

将荧光染色后的血红细胞样品注入到高通量微流控芯片中，芯片中红细胞固定腔室的高度不超过红细胞线度的一倍，红细胞被吸入红细胞固定腔室后被单层固定；

S3、基于单分子定位的超分辨成像

载有红细胞的微流控芯片置于超分辨显微镜上进行成像观察，高密度单分子信号叠加后得到红细胞的超分辨重构图；

S4、单分子追踪分析

低密度单分子信号叠加后进行单颗粒的追踪分析；

在超分辨成像中通过点扩散函数PSF获得的单分子定位信息，得到细胞的定位坐标可以直接应用于单分子追踪分析；

r²是单分子在Δt时间内运动的平方位移，计算如下：

r²(t,Δt)＝(x_t-x_t+Δt)²+(y_t-y_t+Δt)² (1)

其中：Δt是成像拍摄的曝光时间，t为该分子定位的时刻，x_t为t时刻的该分子的x坐标值，x_t+Δt为为t+ Δt时刻的该分子的x坐标值；y_t为t时刻的该分子的y坐标值，y_t+Δt为为t+Δt时刻的该分子的y坐标值；

细胞膜表面单个分子的均方位移MSD，计算如下：