[发明专利]一种生物转化合成5-氟尿嘧啶的方法

说明书

本发明公开了一种生物转化合成5‑氟尿嘧啶的方法，属于生物发酵技术领域。该工艺利用密西根克雷伯氏菌为菌种，利用该菌株湿菌体为酶源将5‑氟胞嘧啶一步转化为5‑氟尿嘧啶。与其他工艺相比，本发明反应体系为纯化水、合成液中各个组分明确，利用该方法得到的5‑氟尿嘧啶易提取，产品质量高，成本低廉且易操作适合工业化，成品含量≥99.9％，具有明显市场竞争力。

技术领域

本发明属于医药合成中生物发酵技术领域，涉及5-氟尿嘧啶的生物合成，具体涉及利用密西根克雷伯氏菌合成5-氟尿嘧啶的方法。

背景技术

克雷伯氏菌属(Klebsiella)为革兰氏阴性杆菌，主要包括肺炎克雷伯氏菌(K.peneumoniae)、臭鼻克雷伯氏菌(K.ozaenae)和鼻硬结克雷伯氏菌(K.rhinoscleromatis)。生物学性状：为较短粗的杆菌，大小0.5-0.8×1-2um，单独、成双或短链状排列。无芽胞，无鞭毛，有较厚的荚膜，多数有菌毛。营养要求不高，有普通琼脂培养基上形成较大灰白色粘液菌落，以接种环挑之，易拉成丝，有助鉴别。在肠道杆菌选择性培养基上能发酵乳糖，呈现有色菌落。

具有O抗原与K抗原，后者用以分型。利用荚膜肿胀试验，本属K抗原可分为82型。肺炎克氏菌大多属3型和12型；臭鼻克氏菌主要属4型，少数为5型或6型；鼻硬结克氏菌一般属3型，但并非所有3型均为该菌。本属细菌在55℃、30分钟内被杀死，在培养基上可存活数周至数月。

5-氟尿嘧啶为抗嘧啶类药物，为白色或类白色的结晶或结晶性粉末。须经过酶转化为5-氟脱氧尿嘧啶核苷酸而具有抗肿瘤活性，通过抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶而抑制DNA的合成。此酶的作用可能把甲酰四氢叶酸的一碳单位也转移给脱氧尿嘧啶核苷酸一磷酸合成胸腺嘧啶核苷一酸。同时对RNA的合成也有一定抑制作用。临床上用于多种肿瘤如消化道肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、绒毛膜上皮癌、宫颈癌、膀胱癌、肝癌、皮肤癌等的治疗有效，尤对消化道癌及其他实体瘤有良好疗效，可静脉或腔内注射，口服吸收不完全。其合成方法主要为化学合成法，采用生物合成从5-氟胞嘧啶直接转化为5-氟尿嘧啶仍然没有突破性进展。

发明内容

为了克服上述缺陷，本发明工艺采用密西根克雷伯氏菌为菌种，利用该菌株湿菌体为酶源将5-氟胞嘧啶转化为5-氟尿嘧啶，工艺简单，成本低廉且易操作适合工业化。

本发明技术方案转化过程包括：菌体制备、固定化酶制备、酶促反应和产品提取等四个过程。详细工艺流程见附图1。

微生物信息：本发明所采用密西根克雷伯氏菌，其拉丁名为以及具体实施方式所使用的密西根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis)已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.16111。

保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018年07月16日。

一、菌体制备

1.1菌体活化及产酶培养

菌种：Klebsiella michiganensis(密西根克雷伯氏菌)

菌株保藏号：CGMCC16111

活化培养基：酵母膏15g/L、氯化钠10g/L、蛋白胨20g/L、pH7.0；

培养条件：38℃，200rpm，12h；

菌体发酵培养基：酵母膏150g/L、玉米浆50g/L、氯化钠15g/L、氯化铵10g/L、氯化钙0.8g/L、硫酸镁0.6g/L、硫酸锰0.8g/L、pH7.0；

培养条件：38℃，DO≥20％，12-24h；

1.2菌体收集