[发明专利]一种体外合成siRNA的纯化方法

说明书

本发明公开了一种体外合成siRNA的纯化方法。本发明的纯化方法具体指体外转录合成siRNA后进行纯化，得到高纯度的siRNA。具体操作流程：将带有T7启动子的DNA模板体外转录合成siRNA；DNaseI降解DNA模板，S1核酸酶降解单链DNA和RNA；磁珠纯化富集siRNA；核酸吸附柱进一步去除小于20nt的核酸、碱基，以得到纯度很高的siRNA。这种制备方式快捷、便宜，且产物的纯度比市场销售的siRNA体外转录试剂盒要高很多，避免了市售体外转录试剂盒得到的产物中有过多杂质，而使实验结果非常不稳定。极大的提高了体外转录制备siRNA的质量，提高实验效率，减少假阴性的实验结果，具有非常高的推广价值。

技术领域

本发明涉及siRNA制备技术领域，尤其涉及一种体外合成siRNA的纯化方法。

背景技术

siRNA技术是上个世纪在植物中发现的。由于它可以作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具，近年来对哺乳动物的研究越来越多。它在生物基因组中特定基因功能的研究、封闭和阻断病原体基因表达等方面，取得了重要进展，显示出良好的应用前景。siRNA技术将在治疗肿瘤、肝炎、遗传性疾病等多种无法治愈的疾病中带来希望，也是目前新药开发的热门。

全球首款非病毒载体给药的siRNA药物patisiran由Alnylam公司研发，是一种特异性沉默hATTR表达的药物。hATTR是人体转甲状腺素蛋白(transthyretin，TTR)淀粉样蛋白沉积引起的，是一种罕见且难以治愈的遗传病。Patisiran与脂质体形成复合物，通过静脉注射给药，沉默人体内hAATR mRNA的表达，减少转甲状腺素蛋白的产生。迄今，Alnylam公司还研发了siRNA药物Givosiran、Iumasiran、Inclisiran。

圣诺制药的在研药物STP705就是一种siRNA疗法药物。它由两种siRNA组成，分别以TGF-β1和COX-2的mRNA为靶向，并通过组氨酸-赖氨酸多肽共聚物(HKP)混合成纳米颗粒制剂。每一个siRNA可以抑制其靶标mRNA的表达，两种siRNA的联合使用，具备减少促纤维化和促炎反应的协同作用。该公司临床前研究表明，药物STP705还有肿瘤抑制的效果。

目前siRNA制备方法有以下几种：1)化学合成法。该方法由核酸合成仪制备得到，适用于短期体外实验研究，可进行化学修饰，如硫代、2-OMe、2-F’等。因为化学合成价格成本较高，一条2OD的21bp siRNA售价约600元，如果添加化学修饰，则价格更高，不适用于长期研究；2)质粒载体合成法。该方法将siRNA序列构建到T7或U6启动子的质粒中，质粒转入细胞，在可在细胞内持续产生siRNA，适用于长期研究。该方法价格较贵，构建过程相对复杂，只适用于体外研究；3)病毒载体合成法。该方法用腺病毒载体或逆转录病毒载体整合siRNA，可进行体内实验。该方法构建过程复杂，成功率相对较低，而且具有安全隐患；4)体外转录法。该方法从带T7启动子的DNA单链开始，四种NTP为底物，退火成两条双链DNA作模板，再添加T7酶转录该模板，得到siRNA。市面上现有的体外转录试剂盒中，通常会将获得的产物再做一步纯化，比如磁珠纯化，表示能得到较高纯度的siRNA。该方法价格低廉，且时间短，可以在短时间内制备，适合体内体外实验。通过AKTA设备分析，该方法的不足之处是虽然能得到目标siRNA，但产物纯度仍需进一步提高，由于该方法容易产生较多的杂质，如错配的短核酸、碱基，使得产物并不适合做更高要求医药级水平的研究和应用。到目前为止，获得高纯度的siRNA的快速、高效、稳定的方法依然是核酸生物医药领域研发的重点之一。

发明内容

为了解决现有体外转录法或者市售试剂盒制备的siRNA纯度不高，影响后续实验结果的问题，本发明提供了一种全新的体外转录合成后进行纯化的方法，旨在获取高纯度siRNA的产物。

本发明的第一个目的是提供一种体外合成siRNA的纯化方法，包括如下步骤：

S1、将含目的基因的DNA单链通过体外转录获得含目的siRNA的体外转录产物；