[发明专利]一种细胞表面聚糖的可激活型标记方法

说明书

本发明涉及一种细胞表面聚糖的可激活型标记方法。利用原子转移自由基聚合(ATRP)技术，在半乳糖氧化酶(GO)表面利用二硫键连接链引发剂，原位可控生长聚合物(PN)，构建聚糖氧化探针GO‑PN。将探针与细胞共温育时，探针上的PN作为物理屏障，使细胞表面聚糖难以接近酶活性中心，GO‑PN无法氧化聚糖末端的半乳糖和N‑乙酰半乳糖胺(Gal/GalNAc)。当向体系中加入还原剂三(2‑羧乙基)膦(TCEP)时，PN和GO之间的二硫键断开使PN解离，探针的酶活性位点得以暴露，氧化细胞表面聚糖的Gal/GalNAc生成醛基。该醛基可进一步与酰肼修饰分子发生高效连接反应，从而实现细胞表面聚糖的可激活型标记。该方法实现了细胞膜聚糖标记的时间控制，为聚糖原位检测和功能研究提供了一种重要的工具。

一、技术领域

本发明涉及一种用于细胞表面聚糖的可激活型标记方法。

二、背景技术

细胞表面有丰富的糖复合物。糖，与核酸、蛋白质和脂类一起，是构成细胞的四种基本组分之一，也是自然界中最为丰富、种类最多的生物大分子。人类蛋白中超过50％是糖蛋白，蛋白质的糖基化增加了分子层面的异质性和功能上的多样性。聚糖在多种生物过程中发挥重要作用，其结构和表达水平与疾病进程密切相关，是很有潜力的疾病标志物和治疗靶标。因此，实现细胞聚糖的可控标记，进而发展聚糖的检测和编辑方法，对疾病的诊断和干预都有着重大意义。

常见的聚糖标记方法包括凝集素识别，糖新陈代谢以及糖修饰酶技术。其中，凝集素识别存在特异性差，亲和力低的缺点；而新陈代谢聚糖标记方法依赖于细胞内部的代谢过程，难以进行调控。糖修饰酶技术通过在细胞外对聚糖进行共价标记，具有特异性高，方法简便等优点。为了调控糖修饰酶的聚糖重构活性，现有方法包括利用金属-有机框架材料或聚乙二醇封装糖修饰酶等。这些方法存在酶封装率低、探针结构组成不确定、酶活性控制困难等缺点。因此亟需发展活细胞适用，可高效激活的聚糖标记方法，为聚糖的原位检测和编辑提供新工具。

为实现酶活性的高效“关-开”转换，本发明在半乳糖氧化酶(GO)表面通过还原剂响应型二硫键原位接枝生长聚合物，利用聚合物的位阻效应调节酶活性中心的可及性。聚合后GO对细胞表面聚糖的重构活性被高效抑制；而在还原剂存在下，二硫键断开使聚合物离去，酶活性中心重新暴露，氧化细胞表面聚糖生成醛基。进一步利用醛基与酰肼修饰分子的生物正交化学反应，实现了细胞聚糖的可激活型标记。该方法为细胞聚糖的检测、干预和功能研究提供了工具，在生物分析、临床诊断、糖组织工程、糖免疫检查点治疗领域具有应用前景。

三、发明内容

本发明的目的是：在糖修饰酶表面通过化学响应型基团原位生长聚合物，该聚合物具有空间位阻效应。利用化学刺激调控酶活性，实现酶活性中心从“封闭”到“暴露”的转换，从而激活对细胞表面的聚糖重构，进一步通过重构糖与标记分子的生物正交化学反应，实现细胞表面聚糖的可激活型标记。

该方法首先利用琥珀酰亚胺3-(2-吡啶基二硫基)-丙酸酯(SPDP)结合巯基置换反应在GO的氨基上通过二硫键连接链引发剂。然后采用原子转移自由基聚合(ATRP)在GO-链引发剂表面原位接枝聚异丙基丙烯酰胺(PN)，制得聚糖氧化探针GO-PN，如图1所示。

本发明提出的细胞表面聚糖的可激活型标记方法如图2所示。酶表面的聚合物起到物理屏蔽的作用，使细胞表面聚糖难以靠近GO-PN的酶活性中心，导致探针表观活性处于“关”状态。而将细胞与GO-PN探针和还原剂三(2-羧乙基)膦(TCEP)共温育时，TCEP切断PN和GO之间的二硫键，使PN离去，此时细胞表面糖链末端的半乳糖和N-乙酰半乳糖胺(Gal/GalNAc)更易接近探针的活性位点，被氧化生成生物正交的醛基，该基团可进一步与酰肼修饰分子反应形成稳定的腙键，从而实现细胞表面聚糖的标记。

本发明通过以下技术方案来实现：