[发明专利]一种β-防御素2抗菌肽的制备方法在审
申请号: | 202111188606.9 | 申请日: | 2021-10-12 |
公开(公告)号: | CN114044817A | 公开(公告)日: | 2022-02-15 |
发明(设计)人: | 沈永刚;肖攀;谢振亮;付坤;沈永良;程益明;胡桂香 | 申请(专利权)人: | 杭州固拓生物科技有限公司 |
主分类号: | C07K14/47 | 分类号: | C07K14/47;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/16;C07K1/06;C07K1/04 |
代理公司: | 杭州山泰专利代理事务所(普通合伙) 33438 | 代理人: | 张飞 |
地址: | 310000 浙江省杭州市经*** | 国省代码: | 浙江;33 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 防御 抗菌 制备 方法 | ||
1.一种β-防御素2抗菌肽的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、选择Fmoc-Pro-2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂,溶胀后脱除Fmoc保护基;
S2、按照β-防御素2抗菌肽的序列,依次从C端到N端进行偶联直至最后一个氨基酸Fmoc-Gly-OH,脱除Fmoc保护基后得到β-防御素2抗菌肽树脂肽,其中,N端第8、15、30、37位使用的氨基酸为Fmoc-Cys(Trt)-OH,第20、38位使用的氨基酸为Fmoc-Cys(Mmt)-OH,N端第1、2、3位使用的反应原料为Fmoc-Gly-Ile-Gly-OH,N端第27、28位使用的反应原料为Fmoc-Ile-Gly-OH;Asp、Thr、Lys、Ser、His、Arg、Tyr、Gln的侧链保护基分别是OtBu、tBu、Boc、tBu、Trt、Pbf、tBu、Trt,所有氨基酸α位氨基的保护基均为Fmoc;
S3、用TFA/DCM溶液与β-防御素2抗菌肽树脂反应,过滤得到带有侧链保护基的β-防御素2抗菌肽,其中第20、38位的Cys侧链巯基裸露;
S4、将带有侧链保护基的β-防御素2抗菌肽与TFA/DCM的混合溶液调节PH值至中性,旋蒸浓缩后,将其溶解到DMF中调节PH值至7.5-8.0,加入H2O2进行氧化反应,反应结束后加水析出后过滤,得到含一对二硫键的β-防御素2抗菌肽;
S5、通过裂解液与上述含一对二硫键的β-防御素2抗菌肽反应,得到脱除所有侧链保护基且含一对二硫键的β-防御素2抗菌肽;
S6、将含一对二硫键的β-防御素2抗菌肽溶解在纯水中,在磷酸缓冲液条件下,持续搅拌反应,最终得到粗品目的产物β-防御素2抗菌肽;
S7、使用半制备色谱纯化分离,冻干后即得到β-防御素2抗菌肽成品。
2.根据权利要求1所述的一种β-防御素2抗菌肽的制备方法,其特征在于,所述偶联体系为:HOBT、HOAT、Cl-HOBT中的任意一个或一个以上与DIC或DIEA与HOBT、HOAT、Cl-HOBT中的任意一个或一个以上与HBTU、HATU、PyBOP或PyAOP中的任意一个或一个以上组成偶联体系。
3.根据权利要求2所述的一种β-防御素2抗菌肽的制备方法,其特征在于,所述Fmoc-Pro-2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂替代度为0.25-0.55mmol/g。
4.根据权利要求3所述的一种β-防御素2抗菌肽的制备方法,其特征在于,所述Cys侧链保护基选择中,包含以下选择方式:N端第15、20、30、38位使用的氨基酸为Fmoc-Cys(Trt)-OH,第8、37位使用的氨基酸为Fmoc-Cys(Mmt)-OH;N端第8、20、37、38位使用的氨基酸为Fmoc-Cys(Trt)-OH,N端第15、30位使用的氨基酸为Fmoc-Cys(Mmt)-OH;N端第8、15、30、37位使用的氨基酸为Fmoc-Cys(Trt)-OH,N端第20、38位使用的氨基酸为Fmoc-Cys(Mmt)-OH。
5.根据权利要求4所述的一种β-防御素2抗菌肽的制备方法,其特征在于,所述的肽链N端第1、2、3位使用Fmoc-Gly-Ile-Gly-OH作为反应原料时,投料倍数为2-3倍。
6.根据权利要求5所述的一种β-防御素2抗菌肽的制备方法,其特征在于,所述肽链N端第1、2、3位使用Fmoc-Gly-Ile-Gly-OH作为反应原料时,偶联体系为:HOBT、HOAT、Cl-HOBT中的任意一个或一个以上与DIC或DIEA与HOBT、HOAT、Cl-HOBT中的任意一个或一个以上与HBTU、HATU、PyBOP或PyAOP中的任意一个或一个以上组成。
7.根据权利要求6所述的一种β-防御素2抗菌肽的制备方法,其特征在于,所述肽链N端第27、28位使用Fmoc-Ile-Gly-OH作为反应原料时,投料倍数为2-3倍。
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