[发明专利]咪达唑仑对体外培养的睾丸间质细胞发育影响的试验方法

说明书

本发明公开了一种咪达唑仑对体外培养的睾丸间质细胞发育影响的试验方法，包括培育大鼠、分离CD90阳性细胞、培育睾丸间质干细胞(SLC)、检测咪达唑仑对增殖和分化的影响、扩增SLCs并检测细胞活力、DAPI染色并计数、流式细胞仪分析细胞、睾酮(T)和孕酮(P4)分析、通过QPCR及WB实验进行mRNA及蛋白表达检测、通过SNK检验确定显著性差异并绘制图表。其步骤简单，可以有效验证咪达唑仑药物对睾丸间质干细胞的增殖和分化的影响。

技术领域

本发明涉及生物化学试验技术领域。

背景技术

咪达唑仑是一种具有多种功能的神经药物，具有镇静、催眠、减轻焦虑、顺行性遗忘、脑介导的肌肉放松和抗惊厥活性的功能。由于该药物经常在儿童和青少年中长期使用，因此还需要研究该药物其他生理系统可能的影响。近几十年来，男性不育率一直在上升，但其背后的原因仍不清楚。最近的一项研究发现，在过去50年中，男性的平均精子数量平均每年下降1.4%，在1973年至2011年间总体下降了52.4%。而睾丸间质细胞（LCs）是雄性哺乳动物（包括男性人类）睾酮（T）的主要来源。雄性激素对维持雄性生殖（包括精子生成）和雄性正常生理功能至关重要。LCs缺陷会导致低血清T水平，除生殖功能外，还可能影响男性的一般生理情况，症状包括身体成分变化、疲劳增加、性功能障碍、情绪低落、认知功能下降和免疫反应降低。因此，发展和维持一个合理水平的功能性间质细胞群对人体是至关重要的。众所周知，睾丸间质细胞的功能及其发育对各种外部影响非常敏感，包括营养、环境污染物和药物。由于咪达唑仑的长期重复使用，目前已有研究发现该药物对神经发育的潜在负面影响进行了评估，发现，青春期使用咪达唑仑可能会影响大脑发育。除了神经系统，青春期也是其他身体器官发育的重要时期，包括生殖系统，并且生殖系统在这一时期特别容易受到外部因素的影响，有研究表明，咪达唑仑可急性影响成人睾丸间质细胞（ALCs）的睾酮分泌。但是目前在青春期反复使用该药物对睾丸间质细胞的发育的潜在长期影响尚不清楚；

随着研究的开展，与人类一样相似的大鼠体内的ALC也是在青春期由睾丸间质干间质细胞（SLC）发育而来的。在成年大鼠中，单剂量的乙烷二甲基磺酸盐（EDS）可完全消除ALC，并在此后的2个月内从SLC重新生成新一代ALC。通过研究发现，这种再生过程所涉及的干细胞与青春期的干细胞完全相同。通过进一步研究发现，EDS后参与ALC再生的SLC特异性表达CD90，可作为分离SLC的表面标记物。通过标记物纯化的SLC在体外可与促黄体生成素（LH）、沙漠刺猬因子（DHH）激动剂（SAG）分化为ALC。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种咪达唑仑对体外培养的睾丸间质细胞（LCs）发育影响的试验方法，其步骤简单，可以有效验证咪达唑仑药物对睾丸间质细胞的增殖和分化的影响。

为实现上述目的，本发明提供了一种咪达唑仑对体外培养的睾丸间质细胞发育影响的试验方法，包括以下步骤，

步骤一，选用2-4个月成年雄性SD大鼠作为实验对象，将EDS溶解于DMSO:PBS=1:3的混合物中，对SD大鼠进行腹腔注射给药，剂量为80mg/kg。经EDS处理四天后，处死SD大鼠；