[发明专利]一种巨噬细胞焦亡模型的构建方法

说明书

本发明提供一种巨噬细胞焦亡模型的构建方法，包括：1)将对数期的巨噬细胞置于DMEM高糖培养基中预处理，所述DMEM高糖培养基中添加有脂多糖(LPS)；2)预处理后，向所述DMEM高糖培养基中加入纳米二氧化硅粉尘或微米二氧化硅粉尘，继续培养适当时间，即得巨噬细胞焦亡模型。本方法可在10h内成功诱导巨噬细胞焦亡，先后添加LPS和二氧化硅粉尘符合细胞焦亡的激发+激活两阶段特点，联合使用LPS+不同粒径二氧化硅粉尘最大限度还原了职业暴露的真实状况，成功体外构建巨噬细胞焦亡模型有利于了解粉尘诱发的各类肺疾病机制，尤其在解析尘肺病、肺癌等发生、启动过程方面有重要价值。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种巨噬细胞焦亡模型及其构建方法和应用。

背景技术

矽肺(pulmonary silicosis)是指由于长期吸入游离二氧化硅(silicondioxide，SiO₂)粉尘所引起的以肺部弥漫性炎症和纤维化改变为主要特征的全身性疾病，该病是我国目前最常见、危害最严重的一种职业病，但其发病机制尚未完全阐明。肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage，AM)是肺部免疫防御的主要参与者之一，负责吞噬经呼吸道途径进入机体的外来异物，在矽肺发病进程中发挥重要作用。游离SiO₂粉尘进入肺泡腔后，首先被活化的AM吞噬，而后产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)并释放炎性细胞因子，其中部分趋化因子诱导炎细胞聚集，在肺间质形成局部炎症微环境，并造成以转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)为主的促炎细胞因子高表达，进而触发肺成纤维细胞增殖和转分化为肌成纤维细胞。源源不断的刺激造成成纤维细胞-肌成纤维细胞稳态右倾，过多的肌成纤维细胞合成胶原蛋白并分泌至肺间质，最终形成矽性蛋白沉积，病理切片表现为典型的矽结节。尽管当前研究对矽肺的发病机制已有初步揭示，但相关精细化调控进程尚未理清，如介导巨噬细胞粉尘吞噬是否存在受体等中间媒介、巨噬细胞吞噬粉尘后的信号传递级联反应、尘细胞的最终归宿等。

作为机体天然免疫反应的一部分，巨噬细胞依赖模式识别受体(patternrecognition receptor，PRR)如TLR4、MARCO等识别SiO₂粉尘，TLR4触发一系列信号转导反应，活化核转录因子κB(Nuclear factor kappa B,NF-κB)，促进合成白细胞介素-1β(interleukin-1β， IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)前体。此外，在吞噬SiO₂粉尘的过程中，AM通过细胞内信号途径可激活NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-likereceptorpyrin domain-containing protein 3，NLRP3)炎性小体并活化caspase-1，对pro-IL-1β等前体及GSDMD进行切割， GSDMD的P30片段在细胞膜上打孔，使胞内IL-1β等炎性细胞因子释放，诱发炎症，这一过程称为细胞焦亡。近年来，许多研究通过建立体内外模型探讨巨噬细胞与SiO₂粉尘之间的关系，申请号为 202010351763.6的中国专利申请中公开了一种光控肿瘤细胞焦亡系统的制备方法，其中公开了利用介孔二氧化碳纳米颗粒诱导肿瘤细胞焦亡的方法和步骤；在申请号为202110763400.8的中国专利申请中公开了富马酸二甲酯在制备抑制二氧化硅晶体诱导的巨噬细胞焦亡药物及治疗矽肺病药物中的应用，其中记载了利用二氧化硅晶体诱导巨噬细胞产生细胞焦亡的方法和步骤。上述专利前者利用介孔二氧化硅作为载体诱导肿瘤细胞焦亡，并未探讨二氧化硅粉尘的焦亡诱导作用，后者证明富马酸二甲酯对5μm晶体二氧化硅诱导的原代巨噬细胞焦亡的抑制作用，且存在二氧化硅剂量单一、粒径覆盖范围狭窄、实验缺乏阳性对照、焦亡信号中间生物标志检测不完整等缺陷。

发明内容