[发明专利]大豆胞囊线虫新小种X12的提纯方法及应用

说明书

本发明提供一种大豆胞囊线虫新小种X12的提纯方法及应用，将鉴定为大豆胞囊线虫X12生理小种的大豆胞囊线虫群体，采用单胞囊繁殖法在国内优异抗源兴县灰皮支(编号：ZDD2315)上连续单胞囊繁殖4代后，继续在兴县灰皮支上纯化、扩繁3‑4代，再利用感病品种Lee恢复1代，实现胞囊的群体纯化及扩繁。该方法能够从自然界混杂的大豆胞囊线虫群体中将具有超强致病力的X12小种分离并纯化，经提纯的X12小种可多代连续用于基因组测序研究、大豆胞囊线虫致病基因研究、大豆抗性资源筛选、抗大豆胞囊线虫基因定位及大豆抗病品种培育过程中表型鉴定筛选研究，在大豆胞囊线虫相关研究方面具有重要应用价值。

技术领域

本发明涉及一种大豆胞囊线虫新小种X12的提纯方法及应用，属于生物技术领域。

背景技术

大豆是人们摄取植物蛋白和植物油的重要来源，因此大豆在农业生产中具有举足轻重的地位。然而，大豆胞囊线虫(Soybean Cyst Nematode,SCN)在世界大豆主产区分布广泛，给大豆生产带来严重经济损失。黄淮地区是我国两大大豆主产区之一，前期研究结果表明，该地区大豆胞囊线虫发生普遍，2号为优势生理小种，其次是5号生理小种。调查研究中，还检测到了具有超强致病力的大豆胞囊线虫新小种X12，该小种能够在我国的优异抗源兴县灰皮支(ZDD2315)及其它目前已公布的所有抗源上成功寄生，属于具有超强致病力的大豆胞囊线虫新小种，该生理小种的发现表明大豆胞囊线虫正进一步威胁大豆生产。

由于大豆胞囊线虫繁殖属于种内杂交，从感染大豆胞囊线虫田块采取的病土中繁殖的胞囊是多个群体混杂的，未经纯化的大豆胞囊线虫混合群体严重阻碍了大豆胞囊线虫在基因组测序研究、大豆胞囊线虫致病基因研究、大豆抗性资源筛选、抗大豆胞囊线虫基因定位及大豆抗病品种培育进程。结合我国“注重资源节约和注重环境友好”的农业绿色发展指导方针，急需培育抗病品种用于防御大豆胞囊线虫给大豆生产带来的经济损失，这是防御大豆胞囊线虫最经济、最有效、最绿色环保措施，而开展大豆胞囊线虫新小种X12的提纯用于筛选抗病资源，是培育抗病新品种的前提。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种大豆胞囊线虫新小种X12的提纯方法及应用，该方法能够从自然界混杂的大豆胞囊线虫群体中将具有超强致病力的X12小种分离并纯化。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种大豆胞囊线虫新小种X12的提纯方法，包括以下步骤：

(1)采集受大豆胞囊线虫X12感染的病土，将病土和无菌细沙以3：0.5～1.0的体积比均匀混合，制备成试验病土，分装在大豆胞囊线虫抗性鉴定用的实验杯中；

(2)将萌发3～5d，子叶出土期的大豆优异抗源兴县灰皮支移栽至装有试验病土的实验杯中，每个实验杯移栽1株，置于温室培养；

(3)培养20～25d后，从根系上用镊子取单胞囊接种至在无菌土中生长了3～5d的兴县灰皮支根系附近，每杯接种单个胞囊，温室培养20～25d；

(4)重复步骤(3)，单胞囊繁殖4次后，将从单个实验杯中搜集的第4代胞囊全部接种至另一杯在无菌土中生长3～5d的兴县灰皮支根系附近，温室培养20～25d后，得到纯化后的第5代胞囊；

(5)将从单个实验杯中搜集的第5代胞囊全部接种到在无菌土中生长3～5d的兴县灰皮支根系附近，温室培养20～25d后，得到纯化后第6代胞囊；

(6)重复步骤(5)，至得到纯化后的第8代或更高代胞囊，将从单个实验杯中得到的第8代或更高代胞囊全部接种至在无菌土中生长3～5d的感病品种Lee根系附近，实现胞囊的群体纯化及加代保存。

所述病土的采集方法为：从受大豆胞囊线虫X12感染的大豆田块采集土壤表层以下2cm-6cm间的土壤，备用。