[发明专利]一种肉鸽小黄卵泡颗粒细胞的分离培养方法

说明书

本发明涉及一种肉鸽小黄卵泡颗粒细胞的分离培养方法，该培养方案步骤如下：选择肉鸽，颈部放血处死，75%酒精擦拭消毒取出卵巢，收集4‑6mm卵泡；剥离卵泡外层血管和结蹄组织；固定卵泡后划开，将卵泡膜层翻转，分离出颗粒细胞层，洗净卵黄；Ⅱ型胶原酶消化，过筛，M199培养基清洗后，离心弃上清；加入含胎牛血清的培养基，重悬颗粒细胞，测定细胞密度；接种至细胞培养皿中，置于培养箱中培养，得到肉鸽小黄卵泡颗粒细胞。本发明的方法不仅适用于小黄卵泡颗粒细胞层分离培养也适用于等级卵泡中颗粒细胞的分离培养；获得的颗粒细胞纯度高、细胞形态正常、活性好，培养方法易操作、重复性强。

技术领域

本发明涉及一种肉鸽小黄卵泡颗粒细胞的分离培养方法，属于生物技术领域。

背景技术

随着畜牧业结构调整，我国肉鸽存栏量不断增加。2019年肉鸽存栏数突破5000万对，肉鸽养殖业已成为特禽养殖业龙头产业。随着人们对蛋肉类食品营养要求的提高，对鸽产品的消费不断增加。鸽属晚成鸟、刺激性排卵，配对后产两枚蛋即开始孵化，鸽的繁殖周期长、产蛋效率低使其不能满足市场需求，严重制约了养鸽业的发展。促进卵泡发育、缩短产蛋间隔是提高肉鸽产蛋效率的重要手段。肉鸽的卵泡发育是一个连续变化的过程，高产的肉鸽的卵泡丰富、而低产肉鸽的卵泡发育不良，卵泡的发育率的降低将导致其产蛋量的减少。卵泡中的卵母细胞主要由外层的膜细胞和内层的颗粒细胞所包围，颗粒细胞在卵泡成熟过程中，开始具备合成孕酮的能力。颗粒细胞由未分化状态向分化状态的转变与卵泡的选择直接相关，卵泡的生存能力在很大程度上归因于颗粒细胞层对凋亡的获得性抵抗，颗粒细胞调控卵泡的选择过程。在肉鸽的卵泡发育过程中，仅有少数等级前卵泡能发育成优势卵泡，而大多数的卵泡则是在不同时期发生闭锁。一般情况下，颗粒细胞先发生凋亡，随后卵母细胞退化死亡，导致卵泡闭锁。颗粒细胞在卵泡的发育和闭锁的过程中起决定性作用，进而影响肉鸽产蛋量。建立肉鸽原代颗粒细胞的体外培养模型为探究肉鸽卵泡发育和闭锁机制提供理论基础。肉鸽在一个产蛋期仅产2枚蛋，其卵泡发育机理不同于其他家禽，关于肉鸽颗粒细胞的培养方法还未见报道。本研究选择直径4-6mm卵泡分离颗粒细胞，进行颗粒细胞原代培养，为研究肉鸽卵泡发育和成熟提供基础，为提高肉鸽产蛋性能具有重要意义。

发明内容

本发明目的在于针对上述的不足之处，为了解决上述技术难点，为探究肉鸽卵泡发育的作用机理提供基础，旨在建立肉鸽小黄卵泡颗粒细胞分离和体外培养的方法，为提高肉鸽产蛋性能提供研究基础，提供一种肉鸽小黄卵泡颗粒细胞的分离培养方法。

本发明的目的是这样实现的：一种肉鸽小黄卵泡颗粒细胞的分离培养方法，特征在于，包括以下步骤：

（1）选择产蛋期肉鸽颈部放血处死，75%酒精擦拭腹部后打开腹腔，取出卵巢和卵泡，并将其迅速放入预冷的PBS中；

（2）将卵泡按照直径大小分离，将4-6mm卵泡转移至新的预冷的PBS中；

（3）用镊子剥离卵泡外层的血管，固定卵泡，将卵泡轻轻划开，迅速将膜层和颗粒细胞层翻出，挤出卵黄，分离颗粒细胞层；

（4）将收集的颗粒细胞层用PBS清洗3次；

（5）将颗粒细胞仔细剪碎，并转移至50mL离心管中，离心弃上清；

（6）加入等体积胶原酶液，轻轻吹打后放入37℃水浴锅15-20min；

（7）加入等体积预冷M199培养基终止消化；

（8）将消化细胞经过灭菌的筛网，移入15mL离心管中，离心弃上清；

（9）清洗2-3次，转移至含胎牛血清的M199培养基的培养皿重悬，细胞计数，达到1.5×10⁶个/mL；

（10）将培养皿转移至培养箱中培养；

（11）培养36h后，更换含胎牛血清的M199培养基，贴壁细胞为颗粒细胞。

步骤（5）中，剪碎的颗粒细胞转移至50mL离心管中离心，离心温度为4℃，转速为1000rpm，离心时间为5min；