[发明专利]一种肉鸽小黄卵泡颗粒细胞的分离培养方法

权利要求书

1.一种肉鸽小黄卵泡颗粒细胞的分离培养方法，特征在于，包括以下步骤：

（1）选择产蛋期肉鸽颈部放血处死，75%酒精擦拭腹部后打开腹腔，取出卵巢和卵泡，并将其迅速放入预冷的PBS中；

（2）将卵泡按照直径大小分离，将4-6mm卵泡转移至新的预冷的PBS中；

（3）用镊子剥离卵泡外层的血管，固定卵泡，将卵泡轻轻划开，迅速将膜层和颗粒细胞层翻出，挤出卵黄，分离颗粒细胞层；

（4）将收集的颗粒细胞层用PBS清洗3次；

（5）将颗粒细胞仔细剪碎，并转移至50mL离心管中，离心弃上清；

（6）加入等体积胶原酶液，轻轻吹打后放入37℃水浴锅15-20min；

（7）加入等体积预冷M199培养基终止消化；

（8）将消化细胞经过灭菌的筛网，移入15mL离心管中，离心弃上清；

（9）清洗2-3次，转移至含胎牛血清的M199培养基的培养皿中重悬，细胞计数，达到1.5×10⁶个/mL；

（10）将培养皿转移至培养箱中培养；

（11）培养36h后，更换含胎牛血清的M199培养基，贴壁细胞为颗粒细胞。

2.根据权利要求1所述的一种肉鸽小黄卵泡颗粒细胞的分离培养方法，特征在于，步骤（5）中，剪碎的颗粒细胞转移至50mL离心管中离心，离心温度为4℃，转速为1000rpm，离心时间为5min；

步骤（8）中，细胞移入15mL离心管中离心，离心温度为4℃，转速为1000rpm，离心时间为5min。

3.根据权利要求1所述的一种肉鸽小黄卵泡颗粒细胞的分离培养方法，特征在于，步骤（6）中，37℃水浴中振荡孵育15-20min，时间掌握以细胞消化情况为准。

4.根据权利要求1所述的一种肉鸽小黄卵泡颗粒细胞的分离培养方法，特征在于，所述培养基为M199培养基中加入10%胎牛血清。

5.根据权利要求1所述的一种肉鸽小黄卵泡颗粒细胞的分离培养方法，特征在于，所述消化酶为按质量百分含量0.1%Ⅱ型胶原酶溶于无血清M199配制而成，配制0.5%Ⅱ型胶原酶为储存液。

6.根据权利要求1所述的一种肉鸽小黄卵泡颗粒细胞的分离培养方法，特征在于，所述筛网为100目不锈钢过滤网。