[发明专利]一种金钱鱼脑细胞的体外培养方法

说明书

本发明公开了一种金钱鱼脑细胞的体外培养方法，包括金钱鱼脑组织获取，消化分离脑细胞，再进行原代培养和传代培养成功获得了一株金钱鱼脑的细胞系。所述金钱鱼脑细胞5天可以铺满瓶，每7天传代一次，现在已经传至20代。培养获得的金钱鱼脑细胞在L15培养基中生长最好，在25℃～30℃之间生长较快。细胞生长速度随着血清浓度(5～20％)的升高而增加，血清浓度为15％和20％时生长最快，血清浓度低至5％时细胞生长缓慢。本发明金钱鱼脑细胞系的成功构建为金钱鱼基因功能和金钱鱼病毒病等的研究提供平行性好、可精准控制条件的实验材料。

技术领域

本发明属于细胞工程技术领域。更具体地，涉及一种金钱鱼脑细胞的体外培养方法。

背景技术

金钱鱼(Scatophagus argus)隶属于鲈形目Perciformes，金钱鱼科Scatophagidae，金钱鱼属Nemipterus，主要分布于印度—太平洋海域。金钱鱼又名金鼓鱼，栖息于沿海水域近岸沿礁、海藻丛生地带，常进入咸淡水或淡水河流中，在我国南海及东海南部均有分布。金钱鱼具有较强的抗逆性，可直接在不同的盐度水体中正常生长，是一种典型的广盐性鱼类。

自世界上第一个鱼类细胞系建立以来，鱼类细胞培养技术发展十分迅速，而我国鱼类细胞培养起步较晚，培养技术尚不成熟，尤其是海水鱼细胞培养依然存在很多难点。与哺乳动物细胞相比，鱼类细胞不需要频繁的传代以保持细胞活力，且具有耐温范围广、取材广泛等特点，被广泛用于免疫学、内分泌学和功能基因组学等研究。近年来，以鱼类细胞为实验对象的研究发展迅速，主要涉及肾脏、肝脏等组织的细胞系。

鱼类细胞分离常用的方法有胰蛋白酶消化法和组织块迁出法。组织块迁出法分离到的细胞完整性较好，但细胞迁出时间较长。胰蛋白酶消化法操作简单，获得细胞量较多，细胞增殖速度也较组织块迁出法更快。细胞迁出后需足够的营养物质和适宜的培养条件才可正常贴壁和生长。

目前，金钱鱼细胞系建立的还不多，主要是金钱鱼肾细胞和鳃细胞的建立，如中国专利CN102634481A公开了一种金钱鱼肾细胞体外培养方法；周佳楠等公开了金钱鱼鳃细胞系的建立(周佳楠,苏冒亮,张俊彬.金钱鱼鳃细胞系的建立及其生长特性的初步研究[J].热带海洋学报,2019,038(006):90-97.)；张莹莹等公开了金钱鱼肾细胞系的建立(张莹莹,梁雪梅,曾文刚,等.金钱鱼肾细胞系的建立及生长特性研究[J].海洋与湖沼(3):6.)；然而，关于金钱鱼脑细胞系建立目前还未见报道，因此，有必要开发一种金钱鱼脑细胞系的培养方法，为金钱鱼基因功能和金钱鱼病毒病等的研究提供平行性好、可精准控制条件的实验材料。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种不同于现有金钱鱼细胞系种类的体外培养方法。

本发明的首要目的是提供一种金钱鱼脑细胞系的体外培养方法。

本发明另一目的是提供一株金钱鱼脑细胞系。

本发明另一目的是提供一株金钱鱼脑细胞系在金钱鱼基因功能和金钱鱼病毒病研究中的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种金钱鱼脑细胞的体外培养方法，包括如下步骤：

S1.原代培养：取健康金钱鱼，消毒后，取出脑组织于漂洗培养液中浸泡除菌，反复漂洗后吸去培养液加入胰酶，切碎，再加胰酶于室温下消化，将消化后的细胞过滤，取滤液，1400～1600rpm离心8～12min，去上清，用原代细胞培养液重悬沉淀，移入培养瓶中，25～30℃培养，每2～4天按半量换液方式更换培养液；所述漂洗培养液为添加有350～450IU/mL青霉素、350～450μg/mL链霉素、450～550μg/mL制霉菌素及2.66g/mL氯化钠的L15培养基；所述原代细胞培养液为添加有350～450IU/mL青霉素、350～450μg/mL链霉素、450～550μg/mL制霉菌素、2.66g/mL氯化钠和10～20％FBS的L15培养基；