[发明专利]一种角膜细胞衰老模型及其建立方法和应用

说明书

本申请提供一种角膜细胞衰老模型，其特征在于，其通过下述步骤构建：细胞培养步骤：使用细胞培养液对角膜细胞进行培养；细胞衰老步骤：弃去细胞培养步骤后的细胞培养液，加入缓冲液，然后在UVA、UVB和蓝光的条件下暴露角膜细胞；再培养步骤：弃去缓冲液，加入无血清培养液，对角膜细胞进行再培养，得到所述角膜细胞衰老模型。还提供上述角膜细胞衰老模型的建立方法以及一种体外评价药物对角膜细胞的抗衰老效果的方法。本申请的角膜细胞衰老模型设备简单、易操作、耗时短、无有毒有害试剂，且能够得到结果重现性高的良好效果。

技术领域

本申请涉及生物医学领域，具体涉及一种角膜细胞衰老模型、角膜细胞衰老模型建立方法及体外评价药物对角膜细胞的抗衰老效果的方法。

背景技术

中华医学会的统计数据显示，随着科技的发展和生活、工作的需要，人们在智能手机、电脑、电视上花费越来越多的时间，到2020年预计增加53％智能手机用户。60％的人每天花费至少6h在数字设备上，63.5％的人因蓝光辐射存在视力下降、白内障、失明等不同程度的眼疾。这些视频显示终端配备的液晶显示器，多采用发光二极管(LED)作为背光源，而LED中蓝光含量极高，对眼角膜造成极大损害。还有随着臭氧层的不断被破坏、户外活动的普及以及科技发展，人类接触紫外线及蓝光的机会增加。而眼睛是一个重要的感光器官，强烈而大量的紫外线会造成眼表的急性损伤如电光性眼炎和雪盲等。而眼睛长期接触紫外线及蓝光会造成慢性损伤如翼状胬肉、白内障以及视网膜黄斑等病变，损伤程度严重，甚至会导致永久性视力伤害。近年来，紫外线及蓝光致眼部损伤机制一般被认为是由于紫外线及蓝光的损伤，细胞产生氧自由基增多，最终导致氧化应激及光化学损伤，诱导角膜细胞走向衰老。

正常角膜为透明、有弹性、不含血管和淋巴管的组织，与巩膜一同构成眼球壁最外层，角膜占眼球壁前1/6，具有保护眼内容物的作用。正常人角膜横径11.5-12mm，垂直径10.5-11mm，正常情况下活体角膜中央厚度最薄，约0.5mm，越靠近角膜缘越厚，平均约1mm。角膜厚度随着年龄的增加有变薄的趋势，即老年人较成年人角膜薄，而成人较儿童薄。角膜从前往后分为五层，依次是上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层、内皮细胞层。角膜上皮细胞约7-14天更新一次。细胞衰老在形态学上表现为细胞结构的退行性改变，如在细胞核，核膜凹陷，最终导致核膜崩解，染色质结构变化，超二倍体和异常多倍体的细胞数目增加；细胞膜脆性增加选择性通透能力下降，膜受体种类、数目和对配体的敏感性等发生变化；脂褐素在细胞内堆积，多种细胞器和细胞内结构发生退行性变。在生理学上的表现为功能衰退与代谢低下，如细胞周期停滞，细胞增殖能力丧失，对促凋亡因素的反应性改变；细胞内酶活性中心被氧化，酶活性降低，蛋白质合成下降等。

现有的衰老模型的制备一般有复制衰老法、氧化应激法、高糖刺激法等。这些方法或者刺激周期长，或者较难造模成功，或者需要使用有毒试剂。但由于眼部主要的伤害来自于光的损伤，所以用光刺激的方法制备眼角膜细胞的衰老模型是比较符合眼部细胞衰老机制的。

发明内容

为克服现有技术中用于制备衰老模型常用方法不符合眼部衰老机制的问题，本申请提供一种角膜细胞衰老模型，其条件温和，不使用毒性试剂，成功率高，还提供一种上述模型的建立方法及体外评价药物对角膜细胞的抗衰老效果的方法。

本申请的具体技术方案如下：

1.一种角膜细胞衰老模型，其特征在于，其通过下述步骤构建：

细胞培养步骤：使用细胞培养液对角膜细胞进行培养；

细胞衰老步骤：弃去细胞培养步骤后的细胞培养液，加入缓冲液，然后在UVA、UVB和蓝光的条件下暴露角膜细胞；

再培养步骤：弃去缓冲液，加入无血清培养液，对角膜细胞进行再培养，得到所述角膜细胞衰老模型。