[发明专利]一种角膜细胞衰老模型及其建立方法和应用

权利要求书

1.一种角膜细胞衰老模型，其特征在于，其通过下述步骤构建：

细胞培养步骤：使用细胞培养液对角膜细胞进行培养；

细胞衰老步骤：弃去细胞培养步骤后的细胞培养液，加入缓冲液，然后在UVA、UVB和蓝光的条件下暴露角膜细胞；

再培养步骤：弃去缓冲液，加入无血清培养液，对角膜细胞进行再培养，得到所述角膜细胞衰老模型。

2.根据权利要求1所述的模型，其特征在于，细胞衰老步骤中，在2～7.2J/cm² UVA、50～126mJ/cm² UVB和1000～2000lux蓝光的条件下暴露所述角膜细胞；

优选地，细胞衰老步骤中，在4～7.2J/cm² UVA、70～126mJ/cm² UVB和1500～2000lux蓝光的条件下暴露所述角膜细胞；

优选地，细胞衰老步骤中，在25℃±5℃的条件下暴露所述角膜细胞。

3.根据权利要求1或2所述的模型，其特征在于，所述角膜细胞为角膜上皮细胞；

优选地，所述角膜细胞为哺乳动物角膜上皮细胞，优选为原代人角膜上皮细胞；

优选地，细胞培养步骤中，培养结束后的角膜细胞为复苏后第3～4代的原代人角膜上皮细胞。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的模型，其特征在于，

细胞培养步骤中，在细胞培养皿上使用细胞培养液对角膜上皮细胞进行培养，当角膜上皮细胞达到80％以上融合时，对角膜上皮细胞进行消化，然后再继续对角膜上皮细胞进行培养；

优选地，细胞培养步骤中，对角膜上皮细胞进行消化后，用完全培养液重悬混匀，以5～10×10³个角膜上皮细胞/孔加入细胞培养板，对角膜上皮细胞进行培养；

优选地，细胞培养步骤中，所述在细胞培养皿和细胞培养板上的细胞培养是在37℃、饱和湿度下、CO₂浓度为5％的细胞培养箱内培养24～48h。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的模型，其特征在于，

细胞衰老步骤中，弃去细胞培养步骤后的细胞培养液，每孔加入100～150μL缓冲液，加盖无菌保鲜膜，然后将所述角膜细胞放入灯箱照射UVA、UVB和蓝光；

再培养步骤中，弃去缓冲液，每孔加入100～150μL无血清培养液，对角膜细胞进行再培养，得到所述角膜细胞衰老模型。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的模型，其特征在于，细胞衰老步骤中，测定UVA计量、UVB计量和蓝光计量的仪器的探头上均覆盖无菌保鲜膜。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的模型，其特征在于，相对于未经照射处理的空白对照组，所述模型的细胞活力降低10％～40％。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的模型，其特征在于，相对于未经照射处理的空白对照组，所述模型的细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率提高15％～70％。

9.一种角膜细胞衰老模型建立方法，其特征在于，其包括以下步骤：

细胞培养步骤：使用细胞培养液对角膜细胞进行培养；

细胞衰老步骤：弃去细胞培养步骤后的细胞培养液，加入缓冲液，然后在UVA、UVB和蓝光的条件下暴露角膜细胞；

再培养步骤：弃去缓冲液，加入无血清培养液，对角膜细胞进行再培养，得到所述角膜细胞衰老模型。

10.一种体外评价药物对角膜细胞的抗衰老效果的方法，其特征在于，其包括：

细胞培养步骤：使用细胞培养液对角膜细胞进行培养；

加药步骤：弃去细胞培养步骤后的细胞培养液，将所述角膜细胞分为第一、二、三组，第一组与第二组加入无血清细胞培养液，第三组加入用无血清细胞培养液稀释的待评价药物；

细胞衰老步骤：分别弃去各组加药步骤后的细胞培养液，加入缓冲液，然后在UVA、UVB和蓝光的条件下分别暴露第二组和第三组的角膜细胞，第一组的角膜细胞不做处理；

再培养步骤：分别弃去各组的缓冲液，加入无血清培养液，对角膜细胞进行再培养，得到角膜细胞衰老模型；

结果评价步骤：测定各组的表征细胞衰老的参数，根据各组表征细胞衰老的参数的结果差异，评价所述药物对角膜细胞的抗衰老效果。