[发明专利]BmSPI38突变体及其应用

说明书

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及BmSPI38突变体及其应用。BmSPI38是由SEQ ID NO.1中第23位至第80位组成，所述BmSPI38突变体是将BmSPI38氨基酸序列中，如SEQ ID NO.1所示第54位的甘氨酸突变为突变为精氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、组氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、缬氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、色氨酸或谷氨酸获得的。本发明的BmSPI38突变体均对枯草杆菌蛋白酶和弹性蛋白酶具有抑制活性，且当突变为精氨酸或赖氨酸后，还获得了胰蛋白酶抑制活性，此类突变体可用于制备胰蛋白酶抑制剂，应用前景良好。

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及BmSPI38突变体及其应用。

背景技术

家蚕是一种具有巨大的经济价值的绢丝昆虫，有大量的基础研究积累，已成为昆虫生物化学、遗传学和基因组学的最佳模型之一。我们前期的研究对免疫相关的家蚕蛋白酶抑制剂进行了系统鉴定，发现很多TIL(trypsin inhibitor-like cysteine-richdomain)类蛋白酶抑制剂在微生物添食感染后上调表达，暗示TIL类蛋白酶抑制剂可能参与家蚕的免疫过程。进一步研究表明，一个家蚕的TIL类蛋白酶抑制剂BmSPI38不仅能够强烈抑制枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶K、球孢白僵菌体壁降解蛋白酶CDEP-1和蜂蜜曲霉蛋白酶的活性，而且能够阻断球孢白僵菌体壁降解蛋白酶CDEP-1诱导的家蚕的过度、有害黑化。

BmSPI38的活性和功能已较为清楚，但是其活性作用机制尚不完全清楚，针对可能影响TIL类蛋白酶抑制剂抑制特异性的潜在氨基酸位点的研究也比较有限，这直接影响了该抑制剂的遗传改造和产业应用。

发明内容

本发明的目的之一是提供BmSPI38突变体，BmSPI38是由SEQ ID NO.1中第23位至第80位组成，所述BmSPI38突变体是将BmSPI38氨基酸序列，如SEQ ID NO.1所示第54位的甘氨酸突变为精氨酸(R)、赖氨酸(K)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)、谷氨酰胺(Q)、天冬氨酸(D)、组氨酸(H)、半胱氨酸(C)、脯氨酸(P)、缬氨酸(V)、天冬酰胺(N)、酪氨酸(Y)、甲硫氨酸(M)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)、异亮氨酸(I)、色氨酸(W)或谷氨酸(E)获得的。

本发明的目的之二是提供所述BmSPI38突变体的构建方法，该方法是利用定点突变引物对如SEQ ID NO.2所示野生型BmSPI38的基因序列进行定点突变，得到所述BmSPI38突变体。

进一步的，所述BmSPI38突变体的构建方法，包括如下步骤：

S1、设计定点突变引物，使上下游引物都带有突变位点；

S2、以BmSPI38-p28作为模板，使用DNA聚合酶，用特异性突变引物进行PCR反应扩增，反应产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测；

S3、利用Dpn I进行酶切反应处理PCR产物；

S4、将酶切反应处理的PCR产物转化入Trans1-T1感受态细胞，挑选阳性克隆进行测序验证，提取突变质粒；

S5、将突变质粒转入宿主表达菌株中，诱导表达得到BmSPI38突变体。

本发明的目的之三是提供编码所述BmSPI38突变体的基因。

本发明的目的之四是提供携带所述基因的质粒。

本发明的目的之五是提供携带所述质粒的宿主表达菌株。

本发明的目的之六是提供所述BmSPI38突变体作为枯草杆菌蛋白酶和弹性蛋白酶抑制剂的应用。