[发明专利]免纯化的活性蛋白表达干燥方法及大规模蛋白突变体库筛选方法

说明书

本发明提供一种免纯化的活性蛋白表达干燥方法，其步骤包括：构建重组蛋白的表达载体；将重组蛋白的表达载体转染到表达菌株中并培养，诱导表达重组蛋白；收集表达菌体，使用干燥剂去除菌体中水分，得到免纯化的活性蛋白。并公开了一种大规模蛋白突变体库筛选方法。本发明可以不经过纯化步骤即可获得高活性和稳定性的重组蛋白。这种工艺包括载体构建及转化、菌体培养、诱导表达、收集菌体和室温干燥几个步骤，具有成本低、蛋白活性好、稳定性高、操作简单、耗时短等优势，既适用于大规模蛋白工业化生产，也适用于大规模蛋白进化改造和理想突变体库的制备与筛选。

技术领域

本发明专利涉及一种免纯化的活性蛋白表达干燥方法及大规模蛋白突变体库筛选方法，属于生物技术领域。

背景技术

重组蛋白纯化技术是生物化学研究过程中应用最广泛的技术之一，也是研究蛋白功能的重要技术，尤其是对于酶功能学的研究。经过纯化的蛋白既可以提高其性能，也能够增强其稳定性。因此，重组蛋白纯化技术是具有重要的商业和科研应用价值。表达目标重组蛋白的宿主细胞需要经过细胞裂解（化学裂解或者物理裂解）、离心取上清、亲和纯化、透析除盐、标签切除、分子筛纯化等一系列才能纯化出有活性的蛋白。为了保证纯化蛋白的稳定性和降低储存运输成本，蛋白质冷冻干燥工艺也成为蛋白大量纯化过程中的重要环节。这不仅需要昂贵的仪器设备和复杂的操作工艺，而且长时间的复杂操作可能会造成蛋白质变性或降解，最终影响纯化蛋白的产量和功能。因此，纯化一批有活性且稳定的蛋白质往往需要数月之久，这不仅极大地增加了研究蛋白质功能以及蛋白质应用的成本，也显著了降低了蛋白质功能研究的效率和成功率，使得蛋白纯化成为蛋白类技术开发和产品生产的关键阻碍。尤其是在研究蛋白定向进化和大规模突变体库筛选领域，往往需要测试成百上千种突变体的性能，以求获得最理想的突变体。大批量的低效率蛋白纯化工作浪费了大量的人力和成本，使得重组蛋白纯化技术难以适用于大规模蛋白突变体库的筛选和工业化生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种免纯化的活性蛋白表达干燥方法，不经过纯化步骤即可获得高活性和稳定性的重组蛋白。

本发明采取的技术方案为：一种免纯化的活性蛋白表达干燥方法，其特征在于其步骤包括：

（1）构建重组蛋白的表达载体；

（2）将重组蛋白的表达载体转染到表达菌株中并培养，诱导表达重组蛋白；

（3）收集表达菌体，使用干燥剂去除菌体中水分，得到免纯化的活性蛋白。

优选的，步骤（3）中干燥剂为无水硫酸钙或者无水氯化钙，干燥的操作在室温下进行。操作时应避免菌体与干燥剂直接接触。

优选的，步骤（3）中干燥时间为6-8 h。

优选的，步骤（1）中的表达载体为原核表达质粒载体，步骤（2）中的表达载体为原核表达载体。

优选的，步骤（3）中采用离心或过滤的方法收集菌体。

本发明还公开了一种大规模蛋白突变体库筛选方法，其特征为：构建具有多种突变类型的靶蛋白表达载体库，按照上述的方法获得免纯化的活性蛋白，检测免纯化的活性蛋白的酶活。

优选的，采用定向DNA突变技术构建具有多种突变类型的靶蛋白表达载体库。

优选的，采用不定向DNA突变技术构建具有多种突变类型的靶蛋白表达载体库。

本发明提供了一种可以免纯化的活性蛋白表达及干燥方法，可以不经过纯化步骤即可获得高活性和稳定性的重组蛋白。这种工艺包括载体构建及转化、菌体培养、诱导表达、收集菌体和室温干燥几个步骤，具有成本低、蛋白活性好、稳定性高、操作简单、耗时短（2-3天）等优势，既适用于大规模蛋白工业化生产，也适用于大规模蛋白进化改造和理想突变体库的制备与筛选。与传统的冷冻干燥技术相比，本发明方法无需冷室和真空干燥设备，更加简单、可操作性更强、成本更低，而且干燥剂本身也可以重复使用，因此工业化生产优势明显。而且本发明方法能保留完整的蛋白活性，在长期储存后，蛋白仍保有高活性。