[发明专利]一种测定蛋白质摩尔消光系数的方法

说明书

本发明提供一种测定蛋白质摩尔消光系数的方法，包括：(1)提供含蛋白质的样品；(2)用水稀释所述样品，获得不同浓度的稀释样；(3)测定各稀释样的紫外吸光度；(4)采用水解衍生仪，将各稀释样用盐酸在130℃‑150℃条件下孵育3–5小时；(5)对(4)中所得各稀释样进行柱前衍生处理；(6)采用超高效液相色谱仪，测定(5)中所得各稀释样中基准氨基酸的含量，算得蛋白质的浓度；和(7)将(3)中所得紫外吸光度和(6)中所得蛋白质浓度线性拟合，由拟合曲线的斜率得到蛋白质的摩尔消光系数。

技术领域

本发明一般涉及蛋白质分析技术领域；具体地，涉及生物制药领域中蛋白质摩尔消光系数的测量。

背景技术

蛋白质抗体类药物质量控制的一个重要指标是制剂中的蛋白质浓度。准确测定蛋白质浓度对蛋白质抗体类药物产品放行中的活性计算、杂质残留量限定及产品分装等具有重要意义。蛋白质浓度通常可以根据Beer-Lambert定律测定一定波长下的紫外吸光度来确定。因此，如何测定准确的蛋白质摩尔消光系数是蛋白质浓度测定的核心问题。

目前常用的蛋白质摩尔消光系数测定方法包括盐酸胍变性法、凯氏定氮法和氨基酸分析法。前两种方法常受到蛋白质制剂中辅料或添加剂的影响及样品需求量的限制。氨基酸分析法基于对组成蛋白质的各类氨基酸的绝对定量来进行蛋白质浓度测量，包括氨基酸分析仪、液相色谱-质谱串联法、高效液相色谱法等。

在采用高效液相色谱法进行的氨基酸分析法中，蛋白质或多肽类样品的水解是直接影响结果准确性的重要因素。并且，鉴于各类氨基酸水解情况不同，为准确测定蛋白质含量，通常会利用水解过程中稳定、蛋白质中含量较高、具有足够分离度和高回收率的氨基酸进行定量分析。蛋白质水解通常采用传统酸解方法进行。然而，传统酸解方法中的加热处理一般不高于110℃，并且需至少24小时才能将蛋白质完全水解成氨基酸，其耗时长，效率低。

为了保证各种氨基酸水解的回收率并提高水解效率，有必要采用更高效的水解方法。此外，需要准确测定水解后氨基酸的含量，以准确测定得出蛋白质的摩尔消光系数。

发明内容

经长期研究，发明人发现并提出了一种测定蛋白质摩尔消光系数的方法。采用本发明所述的方法，能够在4小时内快速酸解蛋白质为游离氨基酸，显著提高蛋白质的水解效率和各类氨基酸的回收率；进一步地，通过柱前衍生法，经超高效液相色谱仪测量，能够准确测定氨基酸含量，算得蛋白质的摩尔消光系数，进而算得待测蛋白质浓度。

本发明所述的方法能够解决传统蛋白质摩尔消光系数检测中水解反应不完全、高耗时、低回收率，以及难以获得蛋白质准确定量的技术问题，提高了蛋白质摩尔消光系数测定的效率和准确性。这对于生物制药产品的生产和质量控制过程中蛋白质浓度的准确测定具有重要意义。

一方面，本发明提供一种测定蛋白质摩尔消光系数的方法，包括：

(1)提供含蛋白质的样品；

(2)用水稀释所述样品，获得不同浓度的稀释样；

(3)测定各稀释样的紫外吸光度；

(4)采用水解衍生仪，将各稀释样用盐酸在130℃-150℃条件下孵育3-5小时；

(5)对(4)中所得各稀释样进行柱前衍生处理；

(6)采用超高效液相色谱仪，测定(5)中所得各稀释样中基准氨基酸的含量，由式(I)算得蛋白质的浓度；和

(7)将(3)中所得紫外吸光度和(6)中所得蛋白质浓度线性拟合，由拟合曲线的斜率得到蛋白质的摩尔消光系数。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本发明的实施方案，而不是为了局限本发明的范围。