[发明专利]一种阿维菌素高产菌株的选育方法

说明书

本发明涉及一种阿维菌素高产菌株的选育方法，优化了阿维菌素菌株的选育方法，采用液滴微流控技术和红外检测筛选联用技术，有效减少菌种选育的工作量，简化整个筛选过程，极大的提高筛选效率，降低选育成本，将阿维菌素的选育周期缩短14天。

技术领域

本发明属于生物发酵医药技术领域，特别是涉及一种阿维菌素高产菌株选育的方法。

背景技术

阿维菌素是由日本北里大学大村智等和美国Merck公司首先开发的一类具有杀虫、杀螨、杀线虫活性的十六元大环内酯化合物，由链霉菌中灰色链霉菌Streptomycesavermitilis发酵产生。包含8个组分，分别为A1a、A2a、A1b、A2b、B1a、B2a、B1b和B2b，其中B1a组分的活性效果最好。阿维菌素作为阿维菌素次级代谢产物的，其代谢存在这巨大且复杂的网络。

传统的菌种选育方法，主要是根据以往的生产经验和现有的生产条件进行的，运用传统的选育方法，经过菌种的分离、挑选单菌落、接种瓶培养基，转发酵瓶培养基，需要耗费大量的时间在菌种的选育过程中。同时，培养完成的斜面菌种需要在0-5℃冰箱中冷藏较长的时间，菌种在冰箱中保藏过程中，低温仅减缓了菌种的生长速率，但菌种未停止生长，因此较长的保藏时间可能导致菌种退化和生产能力降低等。近年来，随着科技的发展，对微生物的研究转向分子方面，而阿维菌素目前已完成了全基因组测序，甚至阿维菌素也进行了基因工程改造，以此方法可按照人们的意愿改造菌种，较大程度的缩短菌种选育的周期，使得优势性状显现出来，有助于提高阿维菌素的生产能力，但其生物合成过程复杂，收到不同水平的控制，代谢活动也未阐明，改造过程的周期较长。因此，上述菌种选育方法不仅存在着菌种选育过程中的随机性，分子改造及选育周期较长，低温冷藏时间长，导致菌种的老化、生产能力及抗性的减弱等，而且，选育过程中，恒温培养间，振荡摇瓶机等设备均处于在性运行状态，设备和资源的利用率低，对于阿维菌素菌种选育工作来说是一个低效率的状态。因此提供一种菌种的快速准确的筛选方法对阿维菌素的生产具有重要的意义。

发明内容

本发明在于提供一种阿维菌素高产菌株的选育方法，采用液滴微流控技术和红外检测筛选联用技术，有效缩短阿维菌素高产菌株的选育周期，提高筛选工作效率。

为实现上述发明目的所采取的技术方案为：

一种阿维菌素高产菌种的选育方法，包括如下步骤：

(1)将待筛选阿维菌素菌株制备成菌悬液；

(2)将步骤(1)所述菌悬液诱变处理得诱变菌悬液；

(3)将步骤(2)诱变菌悬液经液滴微流控技术分散成小液滴培养液；

(4)将步骤(3)小液滴培养液经红外检测筛选得候选小液滴培养液；

(5)将步骤(4)候选小液滴培养液经涂布与培养，斜面培养，接种子瓶培养基，转发酵瓶培养基，最后液相色谱法检测验证菌种的生产能力，高产菌株复筛留种，高产性能考察，最终留种。

本发明在一些实施方式中，其中步骤(1)所述待筛选菌种为已经过活化的斜面菌种。

本发明在一些实施方式中，其中步骤(2)所述诱变为物理诱变或化学诱变。

优选地，所述物理诱变为紫外诱变。

优选地，将活化的菌种菌悬液稀释为10^-3～10^-4，经功率为15w紫外灯诱变30～40s。

本发明在一些实施方式中，其中步骤(3)所述液滴微流控技术，以油为连续相，菌悬液为分散相，将诱变菌悬液分散成小液滴培养液。

本发明在一些实施方式中，其中步骤(3)所述红外检测筛选仪器为MoFlo AstriosEQ超高速流式分选系统。