[发明专利]一种基因工程高产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种基因工程高产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌及其构建方法和应用。本发明通过基因工程方法构建重组质粒pIB139‑RelA，并转入淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes 1628)中构建得到，所述丰加霉素高产粉酶产色链霉菌过量表达天蓝色链霉菌ppGpp合成酶RelA基因，RelA基因过量表达产物可以正向调控丰加霉素生物合成，用于丰加霉素生产。本发明所获得的菌株发酵生产丰加霉素产量至少提高到1568mg/L，是原始菌株产量的10倍，为工业生产提高丰加霉素产量提供新的技术支持。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及基因工程菌株及其构建方法，尤其涉及基因工程高产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌及其构建方法和应用。

背景技术

丰加霉素是一种核苷类抗生素，分子式为C₁₂H₁₃N₅O₄，核糖C1连接类似鸟嘌呤的脱氮杂嘌呤环，核心结构为吡咯嘧啶核苷类似物。其作用机理主要是通过抑制微生物的转运而影响菌体的生长，可以广泛用于医疗、制药、农业等领域。近年来发现，丰加霉素可以用作农用抗生素，抑制多种植物病原真菌的生长，如黄瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌等。此外，丰加霉素由于是链霉菌的天然代谢产物，对环境污染小，对植物生长也有一定的调节作用，是一种理想的生物农药。相对于化学合成，生物法合成效率更高，反应条件温和，对环境污染小，生产成本低，是目前合成丰加霉素的主要技术手段。

丰加霉素是链霉菌的次级代谢产物，合成途径复杂，受到微生物内多种调控因子的调控，单一途径基因的调节无法大幅度提高产物的产量。目前丰加霉素的产量较低，还无法进行工业化生产。采用紫外诱变等方式可以提高次级代谢产物的产量，但是由于次级代谢产物筛选困难，需要大规模的筛选才能获得高产菌株。CN201310170658.2、CN201310170665.2、CN201310168066.7、CN201310170674.1、CN201310168980.1、CN201410783862.6、CN201510966008.8等报道了通过加强淀粉酶产色链霉菌部分基因的表达来提高丰加霉素产量以及通过抗药性突变株筛选提高丰加霉素产量的研究，但丰加霉素产量提高有限。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高丰加霉素发酵产量的方法，通过过表达链霉菌内关键代谢调控因子ppGpp，对胞内的核苷代谢进行调控。同时ppGpp也是链霉菌内代谢的调控因子，可以激活次级代谢途径，激活途径特异性转录调控因子的转录，所以设计通过过量表达天蓝色链霉菌RelA基因，提高淀粉酶产色链霉菌胞内ppGpp合成，从而提高淀粉酶产色链霉菌的丰加霉素产量。

本发明的技术方案如下：

本发明首先提供了一种基因工程高产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌，其为通过基因工程方法由质粒pIB139和RelA基因构建重组质粒pIB139-RelA，并转入淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes 1628)中构建得到，所述丰加霉素高产粉酶产色链霉菌过量表达ppGpp合成酶RelA基因，所述RelA基因序列如SEQ ID No.1所示。

所述淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes 1628)在CN201410128610.X、CN201410128645.3中已经公开，其已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2007年5月25日，保藏登记号CGMCC No.2060.本发明还提供了一种基因工程高产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌的构建方法，其包括如下步骤：

1)以天蓝色链霉菌基因组为模板，以引物RelA-F和RelA-D为引物，PCR扩增获得含有NdeI和XbaI两个酶切位点的RelA基因；

RELA-F的序列为：ggaattccatatgccagacgaggcccagccactgaccg；