[发明专利]一种皱纹盘鲍CRISPR/Cas9基因编辑的方法

说明书

本发明公开了一种皱纹盘鲍CRISPR/Cas9基因编辑的方法，属于水产动物基因编辑技术领域。本发明在显微注射时采用半干露固定方法，不仅能够对皱纹盘鲍进行很好的固定，且极大的提高了注射效率；显微注射中采用最佳的sgRNA和Cas9终浓度，可使注射后的皱纹盘鲍幼虫存活率和编辑效率提高，为采用CRISPR/Cas9基因编辑方法进行皱纹盘鲍基因功能研究和遗传改良奠定基础。

技术领域

本发明属于水产动物基因编辑技术领域，具体涉及一种皱纹盘鲍CRISPR/Cas9基因编辑的方法。

背景技术

鲍鱼是一种单壳、食草、栖息在珊瑚礁的海洋软体动物，分布在世界各地的沿海地区。由于其对珊瑚礁生态系统的影响，它被用于生态研究，也是被用于受精和发育生物学研究的模式动物。由于其营养丰富，鲍鱼成为了世界范围内重要的水产养殖经济贝类。皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)是东亚国家的主要养殖品种。然而目前全基因组选择育种及分子辅助选择育种等技术在鲍鱼遗传育种中还并未得到广泛应用，这其中主要限制因素是鲍鱼基因的功能尚不清楚。目前鲍鱼中开展的基因功能研究多为基因克隆和表达模式分析。

基因编辑技术是研究基因功能最直接有效的方法，在高等动物和模式动物中，基因编辑技术在基因功能研究中已得到广泛应用，从早期的TALENs、ZFNs基因编辑技术，到现在广泛应用的CRISPR/Cas9基因编辑技术。规律成簇的间隔短回文重复序列(Clusteredregularly interspaced shortpalindromic repeats,CRISPR)广泛存在细菌和古生菌内的免疫系统。作为一种编辑工具，CRISPR系统能够定点修饰基因组，其结构分为cas基因、前导区序列、crRNA(包括重复序列和间隔序列)。

与TALENs、ZFNs基因编辑技术相比，CRISPR/Cas9基因编辑技术因具有操作简单、靶点选择广、成本低、效率高等优点，自诞生以来便受到了广大科研人员的关注并得到迅速发展。目前已成为生命科学、医学等研究领域中最受瞩目和最具前景的技术之一。2020年诺贝尔化学奖授予CRISPR/Cas9基因编辑技术，再次证实了该技术的巨大影响力。在基础研究层面，CRISPR/Cas9技术极大促进了模式物种尤其是非模式物种的基因功能研究。目前，CRISPR系统已被广泛应用于药物研制、疾病治疗、动物模型和生物遗传育种等方面，研究者利用CRISPR/Cas9技术已成功的在人类、小鼠、拟南芥、高粱、斑马鱼、线虫、果蝇、山羊、牛、猪、家蚕、牡蛎、脊尾白虾等多种动植物中实现基因编辑。

目前CRISPR/Cas9基因编辑主要借助显微注射技术、电转、病毒介导以及基因枪等技术对受精卵进行Cas9和sgRNA导入。目前利用显微注射进行CRISPR/Cas9基因编辑是最为常用的方法。

然而，目前海洋经济贝类基因编辑技术仍然发展较为缓慢，仅见于少数几个物种，且在仅有的几个物种中，编辑效率仍然较低。鲍鱼中，仅有TALEN基因编辑技术曾见报道，但其操作复杂，编辑效率较低。相较于TALEN基因编辑技术，CRISPR/Cas9基因编辑技术具有操作简单、靶点选择广、成本低、效率高等优点，能够形成更加稳定的技术体系，使基因编辑技术更加广泛的应用于鲍鱼基因功能研究中。

发明内容

本发明的目的在于提供一种皱纹盘鲍CRISPR/Cas9基因编辑的方法。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种皱纹盘鲍CRISPR/Cas9基因编辑的方法，步骤如下：

(1)将目的基因sgRNA与Cas9蛋白混合，并室温孵育获得sgRNA与Cas9的复合物；向复合物中加入小分子染料混合均匀即得CRISPR/Cas9基因编辑的显微注射液；

(2)将皱纹盘鲍受精卵转移至糙面的固体海水琼脂平板上，吸去大量水分，使受精卵呈半干露状固定；