[发明专利]一种皱纹盘鲍CRISPR/Cas9基因编辑的方法

权利要求书

1.一种皱纹盘鲍opsin基因的CRISPR/Cas9基因编辑方法，其特征在于，步骤如下：

(1)将opsin基因sgRNA与Cas9蛋白混合，并室温孵育获得sgRNA与Cas9的复合物；向复合物中加入小分子染料混合均匀即得CRISPR/Cas9基因编辑的显微注射液，其中，opsin基因sgRNA终浓度为100-300ng/μL；所述Cas9蛋白的终浓度为200-600ng/μL；

(2)将人工授精后1h-2h内单细胞期的皱纹盘鲍受精卵转移至糙面的固体海水琼脂平板上，吸去大量水分，使受精卵呈半干露状固定；

(3)采用内径为1-2μm的注射毛细管针吸取步骤(1)制备的显微注射液对步骤(2)固定的皱纹盘鲍的受精卵进行显微注射；

(4)注射后将受精卵置于无菌海水中培养；

所述糙面的固体海水琼脂平板的制备方法为：

将加热后液态的琼脂含量为0.7％或0.8％的海水琼脂倒入培养皿中，在琼脂尚未完全凝固时，将糙面模具倒扣至琼脂表面，使海水琼脂固定后呈凹凸不平状；所述糙面模具为表面布满了划痕的塑料糙面平板；所述划痕长度为3-4mm，深度0.2mm，宽度约0.05mm；

皱纹盘鲍opsin基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述opsin基因sgRNA由以下方法制备而成：

针对CRISPR/Cas9基因编辑的靶位点设计sgRNA特异性引物，将sgRNA特异性引物与通用引物合成sgRNAs DNA模板，将合成的sgRNAs DNA模板体外转录后获得opsin基因的sgRNA；

所述CRISPR/Cas9基因编辑的靶位点为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示核酸序列中的至少一个；

针对SEQ ID NO:2所示靶位点设计的sgRNA特异性引物序列如SEQ ID NO:5所示；

针对SEQ ID NO:3所示靶位点设计的sgRNA特异性引物序列如SEQ ID NO:6所示；

针对SEQ ID NO:4所示靶位点设计的sgRNA特异性引物序列如SEQ ID NO:7所示。

2.根据权利要求1所述皱纹盘鲍opsin基因的CRISPR/Cas9基因编辑方法，其特征在于，所述通用引物序列如SEQ ID NO:8所示。

3.根据权利要求1或2所述皱纹盘鲍opsin基因的CRISPR/Cas9基因编辑方法，其特征在于，所述显微注射液中opsin基因sgRNA终浓度为200ng/μL；所述Cas9蛋白的终浓度为250ng/μL；所述显微注射的体积为每个受精卵0.1nL。