[发明专利]一种TIM-3/CD28融合蛋白及所述融合蛋白修饰的CAR-T细胞

权利要求书

1.一种CAR-T细胞，其特征在于，所述T细胞表面修饰的嵌合抗原受体中，包括一种TIM-3/CD28融合蛋白，包括TIM-3分子的胞外区及CD28分子的跨膜区和胞内区，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述T细胞表面修饰的嵌合抗原受体中包括共刺激分子4-1BB；还包括抗原识别蛋白及跨膜结构域；所述抗原识别蛋白为CD8 SP-FMC63-Fc；所述跨膜结构域采用CD8分子跨膜区；

所述T细胞表面修饰的嵌合抗原受体为CD8 SP-FMC63-Fc-CD8 TM-41BB-CD3ζ-T2A-TIM3 ECD-CD28 TM-CD28 ICD。

2.如权利要求1所述CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞的构建方法，所述构建方法为：首先进行慢病毒包装，待病毒包装成功后再感染T细胞构建CAR-T；

具体步骤为：

（1）取6×10⁶个HEK293T细胞接种于10 cm²细胞培养皿中，过夜，待细胞密度达到80%时，更换6 mL新鲜DMEM培养基；

（2）2h后进行包装病毒，向EP管中混入下述质粒，混匀；加入450 μl无菌水，

；

（3）逐滴加入50 μLCaCl₂，混匀，形成混合液1；

（4）另准备新的1.5 mL EP管，加500 μL2×HBS；

（5）将混合液1加入到步骤（4）中的2×HBS中，混匀，形成混合液2，室温静置15 min，可见浑浊；

（6）将混合液2缓慢加入HEK293T细胞中，十字法混匀，培养箱培养24 h；

（7）24 h后更换6 mL新鲜DMEM培养基，继续培养；

（8）48 h后收集第一批病毒，并加入6mL新鲜DMEM培养基；

（9）72 h后收集第二批病毒，此时可用荧光显微镜观察GFP荧光强度检测转染效率；

收集的病毒离心取上清，用0.22μm的滤膜过滤，然后进行浓缩；浓缩使用Backman超速离心机，32Ti转子，12000 rpm×90 min，弃上清后使用200 μLX-VIVO（loza）培养基重悬，震荡30 min后长期冻存于-80℃，并且对病毒进行滴度检测；

取MOI=50的病毒量感染10×10⁴个T细胞，于24 孔板中离心感染，600 g×60 min，感染后将T细胞转移至新鲜培养基中培养。

3.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-2任一项所述CAR-T细胞；

所述药物组合物中，权利要求1-2任一项所述CAR-T作为活性成分；

所述药物组合物中，还具有其他抗肿瘤活性成分，所述其他抗肿瘤活性成分为包括细胞毒类药物、激素类药物、生物反应调节剂、单克隆抗体中一种或几种；

所述细胞毒类药物为烷化剂、丝裂霉素、拓扑异构酶抑制剂或微管蛋白抑制剂；

所述激素类药物为抗雌激素、孕激素；

所述生物反应调节剂为干扰素或白细胞介素-2；

所述单克隆抗体为利妥昔单抗注射液、注射用曲妥珠单抗、或贝伐珠单抗。