[发明专利]一种表达PRRSV游离受体重组腺相关病毒及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种表达PRRSV游离受体重组腺相关病毒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1，GV461-SRCR59-Fc/Sn4D-Fc重组病毒载体的构建：

首先设计引物对扩增SRCR59-Fc序列，将扩增产物插入至GV461载体的BamHI和SalI酶切位点之间，提取重组质粒GV461-SRCR59-Fc；

然后设计引物对扩增Sn4D-Fc序列，将扩增产物回收后插入至GV461-SRCR59-Fc的HindIII和BglII酶切位点之间，提取重组病毒载体GV461-SRCR59-Fc/Sn4D-Fc；

S2，重组腺相关病毒包装：采用GV461-SRCR59-Fc/Sn4D-Fc、pAAV-Helper、pAAV-RC三种质粒，根据三质粒转染法包装重组腺相关病毒，获得重组腺相关病毒rAAV-CD163-Sn；

S3，将S2中获得的重组腺相关病毒收集、浓缩并纯化。

2.根据权利要求1所述的表达PRRSV游离受体重组腺相关病毒的制备方法，其特征在于，S1中，扩增SRCR59-Fc序列的引物对中上游引物基因序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物基因序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求2所述的表达PRRSV游离受体重组腺相关病毒的制备方法，其特征在于，S1中，扩增Sn4D-Fc序列的引物对中上游引物基因序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物基因序列如SEQ ID NO.4所示。

4.根据权利要求3所述的表达PRRSV游离受体重组腺相关病毒的制备方法，其特征在于，Sn4D-Fc序列融合了剪切肽P2A序列、Sn前4个免疫球蛋白样结构域Sn4D基因序列和猪IgG Fc片段基因序列。

5.根据权利要求4所述的表达PRRSV游离受体重组腺相关病毒的制备方法，其特征在于，所述SRCR59-Fc序列融合了猪IgG重链信号肽序列、猪CD163分子第5到9个半胱氨酸富含结构域SRCR59基因序列和猪IgG Fc片段基因序列。

6.根据权利要求5所述的表达PRRSV游离受体重组腺相关病毒的制备方法，其特征在于，S2中，重组腺相关病毒rAAV-CD163-Sn具体包装过程如下：

分别吸取GV461-SRCR59-Fc/Sn4D-Fc、pAAV-Helper、pAAV-RC三种质粒各10μg，混合后加入1mL 0.3M CaCl₂，混匀后加入至1mL HBS溶液中，然后将混合液滴加至含70％-80％汇合度的AAV-293细胞的培养皿中，混匀后在细胞培养箱放置6小时，随后将培养皿中的培养液弃去，替换为10mL新鲜的培养液，置于细胞培养箱中继续培养66-72小时，收集细胞与培养液，在-80℃冰箱和37℃水浴中交替冻融，重复冻融四次，10000×g离心10分钟，弃去细胞碎片，收集离心上清，该上清即为重组腺相关病毒rAAV-CD163-Sn。

7.根据权利要求6所述的表达PRRSV游离受体重组腺相关病毒的制备方法，其特征在于，S3中，所述重组腺相关病毒的收集、浓缩和纯化过程具体为：

在rAAV-CD163-Sn病毒液中加入40％PEG8000溶液至其终浓度为8％，冰上放置2小时，期间每15分钟混匀一次，2500×g离心30分钟，沉淀用PBS重悬，随后将重悬液3000×g离心30分钟，将上清转移至15mL离心管中，加入Benzonase核酸酶使其终浓度为50U/ml，消化去除残留的质粒DNA，37℃孵育30分钟后，将病毒液用0.45μm滤器进行过滤，将过滤后的病毒液通过CsCl密度梯度离心法进行纯化。

8.一种由权利要求7所述的制备方法制备得到的重组腺相关病毒rAAV-CD163-Sn。

9.一种包含权利要求8所述的重组腺相关病毒rAAV-CD163-Sn的生物制剂。

10.一种权利要求8所述的重组腺相关病毒rAAV-CD163-Sn、或权利要求9所述的生物制剂在制备抗PRRSV感染药物中的用途。