[发明专利]基于CRISPR-Cas系统构建GSTZ1基因敲除细胞系的方法及其应用

说明书

本发明涉及基因工程领域，具体公开了一种基于CRISPR‑Cas系统构建GSTZ1基因敲除细胞系的方法及其应用。本发明基于CRISPR‑Cas系统，成功以人正常肝细胞GSTZ1基因为靶标，获得了高效、特异、精准靶向人正常肝细胞GSTZ1基因的sgRNA分子，如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2所示，能够靶向人正常肝细胞GSTZ1基因，从而引导Cas蛋白对GSTZ1基因的特异性切割，最终达到敲除GSTZ1基因的目的；并且本发明基于CRISPR/Cas‑sgRNA表达系统敲除GSTZ1基因能够影响肝细胞的增殖。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其是涉及一种基于CRISPR-Cas系统构建GSTZ1基因敲除细胞系的方法及其应用。

背景技术

肝脏作为重要的组成器官，在新陈代谢、蛋白质合成和排毒中起着核心作用，受伤时具有独特的再生能力。尽管已经确定了许多在肝脏修复过程中调节细胞增殖的因素，但受伤的肝脏在组织恢复之前维持重要功能的机制尚不清楚。近年来由于肝病极高的发病率，严重影响到了病人的生活，因此研究者们力争利用动物模型去寻求治疗肝损伤的办法。探索肝损伤的机理，使其对于临床上肝病的防治，发病机制的研究和护肝药物的筛选有着重要意义。

谷胱甘肽S-转移酶ζ1(GSTZ1)是近年来发现的谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)超家族新成员之一，也被称为马来酰乙酰乙酸异构酶(MAAI)，主要存在于肝脏和肾脏内、一些植物、真菌和哺乳动物内。人谷胱甘肽S-转移酶ζ1(h-GSTZ1)基因长度大约为10.9kb，有9个外显子和8个内含子构成，定位在人类染色体14q24.3，由216个氨基酸组成，分子量在24kDa左右。GSTZ1主要有2大生物学功能，其一可以参与苯丙氨酸和酪氨酸的分解代谢，催化马来酰乙酰乙酸(MAA)，转化为延胡索酰乙酰乙酸(FAA)；其二催化二氯乙酸盐(DCA)、氟乙酸盐、二氯丙酸酯与GSH加成。

CRISPR/Cas9系统是从细菌和古生菌对抗外来病毒或质粒的适应性免疫系统发展而来，包括三种不同的类型，其中TypeⅡ型的CRISPR/Cas系统的DNA内切酶Cas9只有一个亚基，结构最为简单，所以应用也最广泛。除了Cas9蛋白外，该系统还包括两条短的CRISPRRNAs(crRNAs)和trans-activating crRNAs(tracrRNA)。由于CRISPR/Cas9系统具有操作简单，切割效率高等特点，被认为有更好的应用前景。

目前还没有人公开敲除人正常肝细胞GSTZ1基因是否会影响肝细胞增殖等相关研究。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种基于CRISPR-Cas系统构建GSTZ1基因敲除细胞系的方法及其应用。本发明中sgRNA可以高效靶向人正常肝细胞GSTZ1基因，制备的GSTZ1基因敲除细胞系会影响肝细胞的增殖，促进肝细胞的活力。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

第一目的，本发明提供了一种靶向人正常肝细胞GSTZ1基因的sgRNA，所述sgRNA由sgRNA-F和sgRNA-R组成，sgRNA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，sgRNA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

采用Ensembl和Crispr设计工具及sgRNA的设计原则设计得到上述的sgRNA。

第二目的，本发明提供了一种CRISPR/Cas慢病毒载体，包含上述的靶向人正常肝细胞GSTZ1基因的sgRNA。

作为本发明所述CRISPR/Cas慢病毒载体的优选实施方式，所述CRISPR/Cas慢病毒载体由慢病毒载体lentilCRISPR v2经Esp3I酶切后，连入带Esp3I粘性末端的上述的靶向人正常肝细胞GSTZ1基因的sgRNA重组得到。

第三目的，本发明提供了一种慢病毒，含有上述的CRISPR/Cas慢病毒载体。