[发明专利]一种重组仙台病毒样颗粒的纯化方法及其应用

说明书

本发明公开了一种重组仙台病毒样颗粒的纯化方法，包括如下步骤：S1、细胞裂解，S2、离子交换层析，S3、羟基磷灰石层析，S4、亲和层析，本发明通过特定的、具有顺序的纯化步骤，首先阴进行离子交换层析，之后进行羟基磷灰石层析，最后进行亲和层析，并且上述纯化步骤之间具有协同作用，能较大程度地去除杂质，最后得到纯度极高的重组仙台病毒样颗粒；所述纯化方法操作简单、回收率高，有利于大规模的工业化生产；经过上述方法纯化得到的重组仙台病毒样颗粒可以直接感染细胞，产生相应抗原，诱导机体发生免疫反应；也可以添加相应的佐剂，制成疫苗。

技术领域

本发明属于病毒生物学技术领域，具体涉及一种重组仙台病毒样颗粒的纯化方法及其应用。

背景技术

仙台病毒(Sendai virus，SeV)，又称日本凝血病毒(Hemagglutinating Virus ofJapan，HVJ)，属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)、副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)呼吸道病毒属(Respirovirus)，1953年首次于日本仙台发现，在分离出了第一株病毒Fushimi株之后，人们对仙台病毒进行了广泛的研究和报道。仙台病毒基因由15384个核苷酸构成，其3端为起始序列，之后串连排列6个结构基因-NP-P-M-F-HN-L-，5端为终止序列，对于每个基因RNA聚合酶从3端的起始序列(GS)开始转录，依次为非翻译区(UTR)，开放阅读框(ORF)，到5端的终止序列(GE)mRNA合成终止，相邻基因单位之间有3核苷酸的保守序列(Ⅰ)，外源基因可插入至1-7的任一位置，基因越靠近3端，表达越强，这种表达受位置影响的作用称之为“极性作用”，这是由于聚合酶在从3到5端的移动过程中脱落引起的，通过“极性作用”，可通过对表达基因的要求将其插入到不同位置构建病毒载体。

仙台病毒粒子多呈圆形，直径130～250nm，仙台病毒对乙醚敏感，在pH为3.0的条件下极易灭活，室温条件下可凝集多种动物红细胞，其中以鸡的红细胞凝集价最高。仙台病毒易在鸡胚羊膜腔和尿囊腔中生长繁殖，通常用此方法来扩增病毒，仙台病毒可使小鼠、大鼠、豚鼠等多种啮齿类动物自然感染甚至死亡，迄今为止的研究表明仙台病毒对人类无致病性。仙台病毒在体外试验中可以感染大多数的哺乳动物细胞，并且其转录和复制等生命周期完全在细胞质中进行，没有引起宿主细胞遗传突变的风险，因此，被广泛应用于基因治疗、基因编辑、疫苗研发、癌症治疗等各个领域。

仙台病毒在活载体疫苗上的应用主要是基于其能够激发较强的细胞免疫，可用于传统方法无法实现的疫苗生产，目前已经有若干应用SeV载体构建针对不同病原体活载体疫苗的方案。日本DNAVEC公司已经联合国内几家单位开展应用SeV载体开发HIV疫苗的研究，近期的一项研究是采用DNA疫苗初免，腺病毒活载体疫苗加强免疫，仙台病毒活载体再次加强免疫(Yu S,Xia F,Shu T,et al.Potent specific immune responses induced byprime-boost-boost strategies based on DNA,adenovirus,and Sendai virus vectorsexpressing gag gene of Chinese HIV-1subtype B[J].Vaccine,2008,26(48):6124-6131.)。具体地，在Balb/c小鼠模型中，三种载体联合免疫的细胞免疫效果优于单独应用任何一种载体，且每次加强免疫均可明显上调免疫应答；在猕猴模型中，细胞免疫的持续时间与体液免疫相当，这一方案对于开发HIV预防性或治疗性疫苗有较好前景。