[发明专利]一种东星斑卵原细胞的分离纯化方法及其鉴定和应用

说明书

本发明提供一种东星斑卵原细胞的分离纯化方法及其鉴定和应用，采用本发明的分离纯化方法，可从卵原细胞占比为10％左右的卵巢细胞悬液中，分离纯化得到占比在85.6～90.3％的卵原细胞；而且该方法对细胞的损伤小，获得的细胞活力高，操作过程，简单方便，所用仪器普遍，易于推广和应用；东星斑卵原细胞的鉴定方法，采用杂交显示技术，使用Nanos2探针标记卵原细胞，可快速识别东星斑卵原细胞；本发明的东星斑卵原细胞的分离纯化方法为东星斑生殖发育研究以及后期借助生殖细胞移植技术应用卵原干细胞来扩增东星斑雄性个体提供了技术保障。

技术领域

本发明涉及海水鱼类生殖与细胞培养技术领域，特别涉及一种东星斑卵原细胞的分离纯化方法及其鉴定和应用。

背景技术

鱼类卵原细胞在形态上呈圆形或椭圆形，体积相对较大，细胞核不规则且核质比大，具有1～2个核仁。目前仅部分鱼类的卵原细胞被分析和鉴定，并且在石斑鱼类上有关卵原细胞的鉴定、分离及纯化少有涉及，针对石斑鱼类卵原细胞的研究也是鲜有报道，限制了石斑鱼类卵原细胞的研究与应。因此，开发应用于石斑鱼卵原细胞识别、分离及纯化的方法，对于分析、研究石斑鱼卵原细胞至关重要，也可为借助生殖细胞移植技术应用卵原干细胞来扩增石斑鱼雄性个体提供基础技术保障，缩短石斑鱼育种周期。

豹纹鳃棘鲈(Plectropomus leopardus)，俗称东星斑，属于鲈形目鮨科鳃棘鲈属，广泛分布于太平洋西岸、印度洋等海域。东星斑是雌雄同体且雌性先熟的鱼类，在4～5龄才能性逆转为雄性，导致现存雄鱼亲本种群有限，存在近交严重、种质衰退等问题。另外东星斑已被列为国家二级保护动物，不能通过捕捞野生个体补充雄性亲本资源。因此，雄性亲鱼获取尤为困难，亟需借助新途径缩短雄鱼培育周期，拓宽东星斑雄鱼来源。

鱼类卵原细胞(OSCs)是一群具有自我更新和分化潜能的成体干细胞，随着鱼类生殖细胞移植技术研究的深入，发现其在移植到雄鱼精巢后可以产生成熟的精子。因此，有必要建立石斑鱼类卵原细胞鉴定、分离及纯化的有效方法，以便我们对卵原细胞的深入研究和应用。

发明内容

鉴以此，本发明提出一种东星斑卵原细胞的分离纯化方法及其鉴定和应用。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种东星斑卵原细胞的分离纯化方法包括以下步骤：

1)卵巢预处理：摘取东星斑的卵巢，将卵巢放入5～8倍质量含有双抗的DMEM培养基中，在0～4℃放置10～20min后，清洗卵巢后，放入新的DMEM培养基中，备用；

2)卵巢细胞悬液的制备：取出步骤1)的卵巢，从侧面剪开卵巢，除去卵巢外膜，剪碎组织，加入3～5倍体积的DMEM培养基，进行第一次离心，吸弃上清，向沉淀中加入蛋白酶消化液，在25～30℃消化40～60min后，用70μm滤器过滤，取滤液进行第二次离心，弃上清，除去组织碎片，加入DMEM培养基重悬细胞，使细胞浓度在1.0～5.0×10⁸个/mL，得东星斑卵巢细胞悬液；

3)卵原细胞纯化：配制不同浓度的Percoll溶液，再将各浓度的Percoll溶液配制Percoll密度梯度溶液，将步骤2)的东星斑卵巢细胞悬液1～2mL加到Percoll密度梯度溶液的最上层，水平离心后，从上到下数，取第二层细胞层，得卵原细胞。

优选的，所述东星斑为3～4月龄的东星斑，该月龄的东星斑卵巢处于II时相早期，卵巢大小适中且其中包含大量卵原细胞及少量卵母细胞。

优选的，所述含有双抗的DMEM培养基为含有青霉素和链霉素的DMEM培养基。

优选的，所述青霉素和链霉素的加入量为每1mL DMEM培养基加入300～350IU青霉素和250～300μg链霉素。

优选的，步骤2)中，所述第一次离心为在40～50×g离心5～8min，第二次离心为在0～4℃80～120×g离心10～15min。