[发明专利]一种东星斑卵原细胞的分离纯化方法及其鉴定和应用

权利要求书

1.一种东星斑卵原细胞的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）卵巢预处理：摘取3~4月龄的东星斑的卵巢，将卵巢放入含有双抗的DMEM培养基中，在0~4℃放置10~20min后，清洗卵巢后，放入新的DMEM培养基中，备用；

所述含有双抗的DMEM培养基为含有青霉素和链霉素的DMEM培养基；所述青霉素和链霉素的加入量为每1mL DMEM培养基加入300~350IU青霉素和250~300μg链霉素；

2）卵巢细胞悬液的制备：取出步骤1）的卵巢，从侧面剪开卵巢，除去卵巢外膜，剪碎组织，加入DMEM培养基，进行第一次离心，吸弃上清，向沉淀中加入蛋白酶消化液，在25~30℃消化40~60min后，过滤，取滤液进行第二次离心，弃上清，除去组织碎片，加入DMEM培养基重悬细胞，使细胞浓度在1.0~5.0×10⁸个/mL，得东星斑卵巢细胞悬液；

3）卵原细胞纯化：配制不同浓度的Percoll溶液，再将各浓度的Percoll溶液配制Percoll密度梯度溶液，将步骤2）的东星斑卵巢细胞悬液添加到Percoll密度梯度溶液的最上层，水平离心后，从上到下数，取第二层细胞层，得卵原细胞；

所述Percoll溶液的浓度分别为10％～20％、25％～35％、40％～50％、55％～65％；所述Percoll密度梯度溶液的配制方法为每个浓度的Percoll溶液取1.5~2.0mL，按照浓度从高到低的顺序沿着管壁依次加到离心管，制成Percoll密度梯度溶液。

2. 根据权利要求1所述的东星斑卵原细胞的分离纯化方法，其特征在于，步骤2）中，所述第一次离心为在40~50×g离心5~8min，第二次离心为在0~4℃ 80~120×g离心10~15min。

3.根据权利要求1所述的东星斑卵原细胞的分离纯化方法，其特征在于，所述蛋白酶消化液为每100mL含有0.1~0.3g胰蛋白酶、0.2~0.4g胶原酶H型、3.0~5.0mL胎牛血清和0.02~0.06gDNA酶I的DMEM培养基；所述沉淀和蛋白酶消化液的质量体积比为1g：3~4mL。

4.根据权利要求1所述的东星斑卵原细胞的分离纯化方法，其特征在于，步骤3）中，所述水平离心为在300~500×g水平离心25~40min。

5.根据权利要求1-4任一项所述东星斑卵原细胞的分离纯化方法，其特征在于，所述东星斑卵原细胞在扩增东星斑雄性个体方面的应用。