[发明专利]莲叶桐核酸提取改良版CTAB法

说明书

本发明属于分子生态学实验领域，具体提供了一种针对濒危半红树植物莲叶桐基因组DNA改良版的CTAB提取方法。濒危半红树植物莲叶桐，因富含多糖多酚，其组织研磨液极其粘稠，提取质量好的核酸极其困难。本发明在传统CTAB法基础上采用改进的裂解液对细胞进行裂解，并通过一定比例的Tris平衡酚‑氯仿‑异戊醇混合液进行抽提。再用改进体积的醋酸钠‑异丙醇进行沉淀DNA、纯化DNA，从而获得高质量的基因组DNA。采用本发明提供的濒危半红树植物莲叶桐核酸提取方法提取的DNA浓度高、纯度高，还不易降解，最重要的是能够有效去除多糖多酚。为后续的PCR扩增、分子标记技术开发、基因组文库构建等分子生物学实验奠定基础。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种濒危半红树植物莲叶桐核酸提取改良版CTAB法。

背景技术

莲叶桐(Hernandia nymphaeifolia(J.Presl)Kubitzki)是莲叶桐科、莲叶桐属常绿乔木，莲叶桐材料因富含多糖、多酚、高蛋白，成分特殊，提取液极其粘稠，且容易褐化，所以核酸提取较困难。

传统的CTAB法如下：

(1)称取0.2g样品用液氮研磨成粉,置于2ml离心管中，加入800uL经65℃预热的CTAB裂解液(2％(m/v)CTAB，0.1mol/LTris-HClpH8.0,20mmol/LEDTA,1.4mol/LNaCl).充分混合以后，将其混匀在水浴锅中65℃加热40min,每10min颠倒摇匀数次。

(2)冷却至室温加入等体积的氯仿:异戊醇＝24:1,后充分的颠倒摇匀，25℃，转速设置为每分钟12000rpm,离心约10min。

(3)取上清,加入已预热的1/10倍体积的CTAB/NaCl，充分颠倒混匀。再用相同体积的比例为24:1的氯仿和异戊醇再次抽提，然后低温条件下离心10min，将上清吸取置于2ml的EP管中。

(4)吸取相同体积的CTAB沉淀液于离心管中，进行充分颠倒混匀，在4℃，转速设置为每分钟3500rpm，离心5min，然后取上清，再用500μL的TE缓冲液溶解沉淀，溶解后再加入0.6倍体积的异丙醇，充分颠倒混匀，在4℃，转速设置为每分钟12000rpm,离心15min。

(5)倒上清液，取出一定量70％的乙醇冲洗白色沉淀2次。放置在室温条件下进行风干之后用0.1mLTE缓冲液进行溶解。

采用传统的CTAB法提取的莲叶桐植物基因组DNA过程中出现裂解时细胞裂解不完全，抽提过程中除糖和蛋白不完全，DNA沉淀出现胶状，点样跑胶时出现枪头拉丝，DNA主条带不清晰等问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种适用于莲叶桐核酸提取的方法，解决采用传统CTAB法提取时出现的细胞裂解不完全，抽提时多糖处理不干净，点样跑胶时出现枪头拉丝、DNA主条带不清晰等问题。

本发明的技术方案为：莲叶桐核酸提取的方法，包括如下步骤：

(1)取适量新鲜莲叶桐叶片，置于预冷的研钵中，加入液氮充分研磨，将粉末转至离心管中，加入预热温度为65℃的裂解液，混匀，加入RNA酶，涡旋震荡1min，混匀后65℃水浴锅中水浴加热40min，每隔10min颠倒摇匀一次，所述裂解液组成为：2％(m/v)CTAB,0.1mol/L Tris-HCl pH8.0,20mmol/L EDTA,1.4mol/L NaCl,2％(m/v)β疏基乙醇，2％(m/v)PVP；

(2)放置冷却至室温，加入等体积的Tris平衡酚︰氯仿︰异戊醇＝25︰24︰1,在转速为11000～13500rpm室温下离心10～15min；

(3)取上清液转入一新离心管，加入1/10倍体积的3mol/LNaAc和等体积的异丙醇，混匀于-20℃放置40～60min，在转速为11000～13500rpm 4℃离心10～15min；