[发明专利]一种脂肪间充质干细胞库的构建方法

说明书

本发明公开了一种脂肪间充质干细胞库的构建方法，包括以下步骤：（1）对选取的合格离体脂肪样本供体建立登记档案；（2）取离体的脂肪组织经消化、分离得到脂肪间充质干细胞；（3）将步骤（2）分离得到脂肪间充质干细胞接种在纯化培养基上，培养至细胞汇合度达到80‑85%时消化，离心，向细胞中加入纯化培养基重悬，记为P0代细胞；（4）将P0代细胞采用上述纯化培养基进行传代培养，取传代培养得到的P3代细胞进行冻存，构建脂肪间充质干细胞库；本发明还具体限定了纯化培养基的组成。本发明提供的细胞库的构建方法可以充分满足脂肪间充质干细胞的科研和临床应用。

技术领域

本发明涉及一种细胞库的构建方法，尤其涉及一种人脂肪间充质干细胞库的构建方法。

背景技术

干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据发育阶段的不同，干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞虽然能分化为多种不同的组织，但在细胞分化调节和伦理上局限性限制了其临床应用。间充质干细胞是目前备受关注的一类具有多向分化潜能的成体干细胞。

脂肪间充质干细胞是从脂肪组织获得的一类有多向分化潜能的间充质干细胞，其在特定诱导条件下可以向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞，甚至神经细胞分化。和骨髓来源的间充质干细胞相比，脂肪干细胞更具有稳定性和不易衰老性，是组织工程中不可多得的优质种子细胞；脂肪间充质干细胞(ADSCs)作为来源于脂肪的间充质干细胞，具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞，适宜大规模培养，并且取材过程对机体损伤小。脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞相比，具有更低的免疫源性，移植的时候不会被机体当作外来物而排斥，适宜自体移植、安全性能高，脂肪间充质干细胞库的建立逐渐成为近年来新的研究热点之一。

现有的脂肪间充质干细胞库的建立过程繁琐，在细胞获取过程中加入的胎牛血清等外源性血清影响细胞库中脂肪间充质干细胞的质量，因此极大的限制了脂肪间充质干细胞的临床应用。随着各个领域对干细胞需求量的增加，有必要对脂肪间充质干细胞库的建立过程进行改进，提高脂肪间充质干细胞库的建立效率，促进脂肪间充质干细胞在各个领域的广泛应用。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种脂肪间充质干细胞库的构建方法，有效提高细胞库中细胞的纯度和活性，为脂肪间充质干细胞的临床应用提供保障。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

一种脂肪间充质干细胞库的构建方法，包括以下步骤：

（1）对选取的合格离体脂肪样本供体建立登记档案；

（2）取离体的脂肪组织经消化、分离得到脂肪间充质干细胞；

（3）将步骤（2）分离得到脂肪间充质干细胞接种在纯化培养基上，培养至细胞汇合度达到80-85%时吸弃培养基，加入0.25%胰酶进行消化，加入PBS稀释后离心，向细胞中加入纯化培养基重悬，记为P0代细胞；

（4）将P0代细胞采用上述纯化培养基按照1：2-3的比例进行传代培养，取传代培养得到的P3代细胞进行冻存，构建脂肪间充质干细胞库；

所述纯化培养基的组成为：基础培养基和添加在基础培养基中的以下成分：谷胱甘肽、D-柠檬烯、雷诺嗪、刀豆蛋白A、维生素C、亚硒酸钠、L-精氨酸。

进一步地，所述纯化培养基的组成为：基础培养基DMEM/F12，添加在DMEM/F12培养基中各成分以终浓度计：谷胱甘肽20-25μg/mL、D-柠檬烯8.5-11.5ng/mL、雷诺嗪5.8-7.2ng/mL、刀豆蛋白A 6.5-8.9ng/mL、维生素C 1-5μg/mL、亚硒酸钠2.5-4.5ng/mL、L-精氨酸5-10μg/mL。