[发明专利]一种脂肪间充质干细胞库的构建方法

权利要求书

1.一种脂肪间充质干细胞库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）对选取的合格离体脂肪样本供体建立登记档案；

（2）取离体的脂肪组织经消化、分离得到脂肪间充质干细胞；

（3）将步骤（2）分离得到脂肪间充质干细胞接种在纯化培养基上，培养至细胞汇合度达到80-85%时吸弃培养基，加入0.25%胰酶进行消化，加入PBS稀释后离心，向细胞中加入纯化培养基重悬，记为P0代细胞；

（4）将P0代细胞采用上述纯化培养基按照1：2-3的比例进行传代培养，取传代培养得到的P3代细胞进行冻存，构建脂肪间充质干细胞库；

所述纯化培养基的组成为：基础培养基和添加在基础培养基中的以下成分：谷胱甘肽、D-柠檬烯、雷诺嗪、刀豆蛋白A、维生素C、亚硒酸钠、L-精氨酸。

2.根据权利要求1所述脂肪间充质干细胞库的构建方法，其特征在于，所述纯化培养基的组成为：基础培养基DMEM/F12，添加在DMEM/F12培养基中各成分以终浓度计：谷胱甘肽20-25μg/mL、D-柠檬烯8.5-11.5ng/mL、雷诺嗪5.8-7.2ng/mL、刀豆蛋白A 6.5-8.9ng/mL、维生素C 1-5μg/mL、亚硒酸钠2.5-4.5ng/mL、L-精氨酸5-10μg/mL。

3.根据权利要求2所述脂肪间充质干细胞库的构建方法，其特征在于，所述添加在DMEM/F12培养基中各成分以终浓度计：谷胱甘肽23μg/mL、D-柠檬烯10ng/mL、雷诺嗪6.5ng/mL、刀豆蛋白A 7.4ng/mL、维生素C2.5μg/mL、亚硒酸钠3ng/mL、L-精氨酸8μg/mL。

4.根据权利要求1所述脂肪间充质干细胞库的构建方法，其特征在于，步骤（2）将脂肪样本离心后取上层的脂肪组织，用PBS清洗后再次离心，向离心后的脂肪组织中加入1%Ⅱ型胶原酶震荡消化30min，消化完成后加入PBS稀释后离心，沉淀即为脂肪间充质干细胞。

5.根据权利要求1所述脂肪间充质干细胞库的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）中分离得到的脂肪间充质干细胞在纯化培养基中的密度为1-5×106个/mL，细胞在37℃，5%CO2的培养箱中进行培养，培养过程中每2天更换一次培养基。

6.根据权利要求1所述脂肪间充质干细胞库的构建方法，其特征在于，步骤（3）中P0代细胞在纯化培养基中重悬后的密度为1-5×105个/mL。

7.根据权利要求1所述脂肪间充质干细胞库的构建方法，其特征在于，步骤（4）中取培养至融合度70-80%的P3代细胞用0.25%胰酶消化后加入PBS稀释，取部分细胞进行计数，测定细胞活率，检测细胞增殖活性、纯度及多向分化能力，将剩余细胞离心后分离上清液和细胞分离，向离心后的细胞中加入冻存液进行重悬，细胞密度为1-8×107个/mL，将冻存液分装在2mL的冻存管中，每管1mL，标记冻存日期及细胞信息档案后在液氮中进行冷冻保存。