[发明专利]一种水禽H5N8亚型流感病毒HA重组蛋白及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及一种水禽H5N8亚型流感病毒HA重组蛋白及其制备方法与应用，所述HA重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述HA重组蛋白的编码基因，它的序列如SEQ ID NO:1所示；本发明的HA重组蛋白与通过计算优化得到的广谱反应HA蛋白(PDB ID 6NTF)具有相同或相似的抗原表位，且共有氨基酸序列之间不包含重大结构变化，这为基因工程亚单位疫苗研发提供了可能，经血凝活性试验证实本发明表达的HA重组蛋白生物活性好；可用于制备水禽H5N8亚型流感病毒亚单位疫苗中。

技术领域

本发明属于人用疫苗和生物制品领域，涉及一种基因工程疫苗，具体涉及一种水禽H5N8亚型流感病毒HA重组蛋白、编码基因、重组载体、免疫组合物、 HA重组蛋白的制备方法以及HA重组蛋白的应用。

背景技术

高致病性禽流感(highly pathogenic avian influenza，HPAI)是由H5亚型或其重组毒株(包括H5N2、H5N5、H5N6和H5N8)流感病毒引起的一种禽类的烈性传染病，引起家禽和野生鸟类数千次暴发并造成大量死亡，对世界家禽业造成了巨大经济损失。近年来，高致病性H5N8病毒在全球迅速蔓延，对家禽业和人类健康构成巨大的威胁。高致病性H5N8病毒的血凝素(hemagglutinin， HA)蛋白编码片段是高致病性H5N1病毒(A/Goose/Guangdong/1/1996)的衍生，导致许多家禽和野生鸟类死亡，对我国养禽业存在危害，因此，加大对流感疫苗研究力度对养殖业的可持续发展具有重要的意义。HA蛋白是A型流感病毒主要表面抗原和保护性抗原，是中和性抗体的重要靶点，是国内外禽流感研究的重点和热点。

目前，在我国广泛用于防控禽流感疫苗为H5亚型基因重组灭活疫苗，但在实际应用中鸡的免疫效果优于水禽，且以鸡胚为基础生产的流感疫苗在扩大生产规模和通过鸡胚传递可能对疫苗病毒株的抗原性生产有相当大的局限性，需要大量工作、存在生产工艺繁杂、成本高、免疫应答较迟、免疫次数较多等缺点。因此，高效、安全、低成本的禽流感新型疫苗的研制一直是科研人员关注的焦点。禽流感亚单位疫苗，主要是基于HA保护性抗原制成的亚单位疫苗，亚单位疫苗不存在毒力返强、散毒和环境污染的问题，相对稳定和生物安全性好。嗜热四膜虫表达系统在流感大流行时期，如果流行病学监测过程中发现流感毒株发生明显的抗原变异，而四膜虫工程株可快速制备HA抗原，从而为调整研制新的亚单位疫苗奠定基础，是制备禽流感病毒疫苗的潜在候选者。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水禽H5N8亚型流感病毒HA重组蛋白、编码基因、重组载体、免疫组合物、HA重组蛋白的制备方法以及HA重组蛋白的应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

本发明利用从自然环境中分离得到的H5N8亚型禽流感毒株(FJ20048病毒)，通过HA氨基酸序列同源进化分析，发现从自然环境中分离得到H5N8亚型禽流感毒株HA多肽能引起动物机体广泛免疫应答。然后将密码子优化后HA 基因序列构建到pD5H8表达载体当中，以嗜热四膜虫为表达系统，通过基因枪将阳性重组质粒转入四膜虫工程株并进行同源重组，诱导表达H5亚型禽流感病毒HA蛋白，免疫小鼠对同源流感病毒的攻击具有良好的免疫保护作用。

本发明提供了一种水禽H5N8亚型流感病毒HA重组蛋白，所述HA重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明提供了所述的水禽H5N8亚型流感病毒HA重组蛋白的编码基因，它的序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供了一种包含所述编码基因的重组载体。

所述重组载体包括pMD18-T、pEASY Blunt Zero Vector、pTIEV4或pD5H8 等。

本发明还提供了一种包含所述编码基因的宿主细胞。

所述宿主细胞包括嗜热四膜虫株、293T细胞、sf9昆虫细胞、DG44、DXB11、 CHO-K1或CHO-S细胞株等。