[发明专利]一种转化乳糖生成乳果糖的植物乳杆菌工程菌株及其构建方法与应用

说明书

本发明涉及一种转化乳糖生成乳果糖的植物乳杆菌工程菌株及其构建方法与应用。本发明主要以植物乳杆菌NZ0203为基础，在植物乳杆菌NZ0203中过表达纤维二糖2‑差向异构酶。构建的植物乳杆菌工程菌株不消耗乳糖和乳果糖，有利于乳糖转化反应的进行以及乳果糖产物的积累，使得乳果糖产率显著提高，适用于乳果糖的高效生产。与酶促法生产乳果糖不同，本发明提供的乳果糖生产方法利用全细胞来催化，具有降低酶纯化成本和多次使用的优势，且利用益生菌来生产的益生元，更能够为人们所接受。

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种转化乳糖生成乳果糖的植物乳杆菌工程菌株及其构建方法与应用。

背景技术

乳果糖(4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-果糖)是一种双糖，由一分子果糖和一分子半乳糖通过β-1,4-糖苷键连接而成。以乳糖作为底物，在异构化作用下能够生成乳果糖。这一反应对乳制品工业具有重要价值，因为乳糖广泛的存在于乳清中，而世界上大约30-50％的奶酪乳清仍未被利用。除了能够降低乳清带来的环境污染之外，乳果糖还具有很高的附加价值。乳果糖可用于制药工业，因为它具有治疗肝性脑病和慢性便秘的功效。其作为益生元，乳果糖可作为双歧杆菌因子添加到婴儿配方奶粉中(用于功能性食品)。此外，根据欧洲食品安全局，乳果糖可减少潜在致病性胃肠道微生物并减少肠道转运时间。

乳糖转化为乳果糖的异构化作用，可以通过化学方法和酶促方法来实现。这两种方法都有其固有的局限性，但是基于合成的可行性和相关的环境考虑，利用酶促反应合成乳果糖比化学方法更有吸引力。因为酶促方法安全无毒，环保且成本更低。一般来说，有两种合适的酶类能够催化乳果糖的合成，即糖基转移酶和糖苷酶。在这两类酶中，糖苷酶与工业应用关系更密切(例如，β-半乳糖苷酶)，因为它们是市售的，相对便宜，并且已经广泛用于食品工业。利用这两种酶实现的乳果糖的转化产率为5％-15％。可以看出，低反应收率是酶促方法合成乳果糖的主要挑战。近年来，纤维二糖2-差向异构酶在乳果糖生产中的应用受到重视，其能够将乳糖中的葡萄糖部分异构化为果糖以产生乳果糖。目前已经报道了解糖热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor saccharolyticus)的纤维二糖2-差向异构酶，获得了58.3％的产率。

在利用酶促反应转化乳糖生成乳果糖的过程中，一般都是利用纯化的酶来开展，但是利用产酶菌株的全细胞进行催化反应，可以多次重复利用且避免酶的纯化，从而提高经济效益，简化生产方法。中国专利文献CN104004699A(申请号201410262301.1)公开了一种全细胞催化产乳果糖的方法，以产纤维二糖差向异构酶的重组大肠杆菌BL21(DE3)作为生产菌株，以乳糖替代异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂进行发酵培养，离心所得菌体经乙醇透化、真空冷冻干燥处理作为细胞生物催化剂，直接转化乳糖生产乳果糖。中国专利文献CN105255805A(申请号201510782905.3)公开了一种利用重组枯草芽孢杆菌生产乳果糖的方法，以重组枯草芽孢杆菌作为生产菌株，该重组菌包含了能够催化乳糖生产乳果糖的纤维二糖差向异构酶，通过乳糖或异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，以乳糖或乳清为底物进行生物催化反应。植物乳杆菌是一种重要的乳酸菌，其不仅具有公认的安全性，也是一种具有应用潜力的细胞工厂，但在乳果糖的生产中却鲜有研究。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种转化乳糖生成乳果糖的植物乳杆菌工程菌株及其构建方法与应用。

本发明以不利用乳糖和乳果糖的植物乳杆菌基因敲除株为基础，插入优化的纤维二糖2-差向异构酶基因，过表达纤维二糖2-差向异构酶，利用获得的工程菌株采用全细胞催化法或同步生长发酵法生产乳果糖。

本发明的技术方案如下：

一种转化乳糖生成乳果糖的植物乳杆菌工程菌株，是以敲除β-半乳糖苷酶编码基因lacA和lacLM的植物乳杆菌为基础，插入纤维二糖2-差向异构酶的编码基因。