[发明专利]视网膜色素上皮细胞诱导培养基及其应用

说明书

本发明涉及一种视网膜色素上皮细胞诱导培养基及其应用。该诱导培养基为包含如下成分的Neurobasal培养基：B27补充剂、L‑谷氨酰胺1mM～5mM、丙酮酸钠0.5mM～3mM、β‑巯基乙醇0.05mM～0.15mM、L‑抗坏血酸30mM～120μM、cAMP 0.5mM～3mM、BMP抑制剂30nM～120nM、GSK‑3β抑制剂5μM～20μM、ALK抑制剂5μM～25μM以及SHH 15ng/ml～60ng/ml。该培养基可由人视网膜色素上皮细胞为原料定向分化培养得到能够产生多巴胺的多巴胺能神经元样细胞。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体而言，涉及一种视网膜色素上皮细胞诱导培养基及其应用。

背景技术

帕金森病是老年人群中最常见的神经退行性疾病之一。帕金森病患者通常患有静息震颤、僵硬、运动功能减退、步态、平衡和自主功能障碍、抑郁症和痴呆症。从病因学的角度来看，帕金森病是由黑质致密部产生多巴胺的神经元丢失引起的黑质-纹状体神经元投射是疾病期间运动症状的原因。从中脑多巴胺神经元的改变开始，这种疾病最终会影响前脑神经元，如皮质神经元。在过去十年中，已经确定了几个易感性因素。这研究表明，蛋白质错误折叠、氧化应激异常增加、线粒体功能障碍以及泛素-蛋白酶体和自噬-溶酶体系统的损伤都可能导致帕金森病的发展。

帕金森病患者目前接受多种药物治疗，包括左旋多巴、多巴胺激动剂和单胺氧化酶B抑制剂。其中，左旋多巴是最有效的药物，但经常观察到不希望的副作用，包括PD症状的波动和运动障碍。双侧丘脑底核或苍白球中间核(GPi)深部脑刺激(DBS)可改善患者的病情，减少其左旋多巴的每日剂量，并改善左旋多巴相关的运动并发症和运动障碍。尽管如此，据报道DBS会导致严重的抑郁症。尽管症状管理有所改善，但所有这些疗法都不能阻止疾病的发展。希望通过替换患病的神经元来阻止疾病的发展，细胞疗法已经在临床试验中用于治疗患有帕金森病的动物或帕金森病患者。在这方面，胎儿来源的神经干细胞(NSCs)是第一个被研究的细胞类型，其次是间充质干细胞、从胚胎干细胞(ES)分化而来的多巴胺能神经元和诱导多能干细胞(iPS)。然而，安全性问题、伦理问题和过度移植细胞中多巴胺产生的能力限制了帕金森病患者的临床应用。为了寻找帕金森病治疗的替代细胞来源，一项使用人胎儿视网膜色素上皮细胞的开放标记先导研究报告称，移植后12个月内观察到，该研究能够改善患者的状况。然而，一项使用相同视网膜色素上皮细胞的随机双盲研究没有证实相同的治疗效果。此外，在临床使用胎儿组织方面仍存在伦理问题。

本发明的发明人此前曾经进行过诱导视网膜色素上皮细胞向多巴胺能神经元样细胞诱导分化的研究，但所采用的诱导培养方法仍然存在多巴胺产量不高的问题。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明涉及一种视网膜色素上皮细胞诱导培养基，其为包含如下成分的Neurobasal培养基：

B27补充剂、L-谷氨酰胺1mM～5mM、丙酮酸钠0.5mM～3mM、β-巯基乙醇0.05mM～0.15mM、L-抗坏血酸30mM～120μM、cAMP 0.5mM～3mM、BMP抑制剂30nM～120nM、GSK-3β抑制剂5μM～20μM、ALK抑制剂5μM～25μM以及SHH 15ng/ml～60ng/ml。

可选的，如上所述的视网膜色素上皮细胞诱导培养基，其为包含如下成分的Neurobasal培养基：

B27补充剂、L-谷氨酰胺2mM～4mM、丙酮酸钠1mM～2mM、β-巯基乙醇0.05mM～0.15mM、L-抗坏血酸50mM～100μM、cAMP 1mM～2mM、BMP抑制剂50nM～100nM、GSK-3β抑制剂10μM～15μM、ALK抑制剂10μM～20μM以及SHH 20ng/ml～50ng/ml。

可选的，如上所述的视网膜色素上皮细胞诱导培养基，所述B27补充剂的添加量为所述Neurobasal培养基体积的1/60～1/40。