[发明专利]一种同时制备人纤维蛋白原、凝血因子Ⅷ和纤溶酶原的方法

权利要求书

1.一种同时制备人纤维蛋白原、凝血因子Ⅷ和纤溶酶原的方法，其特征在于，从血浆中分离凝血因子Ⅷ的同时，以副产物PEG沉淀为原料，同时制备人纤维蛋白原和纤溶酶原；所述制备方法具体包括：

S1.血浆混合后离心分离冷沉淀；

S2.将所述冷沉淀用氨丁三醇溶液洗涤后虹吸，废弃上清；

S3.将步骤S2得到的沉淀溶解，加入PEG3350，使PEG3350浓度到达3.5%±0.5%，并调整pH至6.00～7.00，离心后分别收集上清液和PEG沉淀，其中凝血因子Ⅷ存在于所述上清液中，人纤维蛋白原和纤溶酶原形成所述PEG沉淀析出；

所述步骤S3中采用氨丁三醇进行溶解，氨丁三醇浓度为0.01~0.1mol/L，pH6.50～7.50，溶解温度为25～35℃，溶解倍数为3～5倍，

所述凝血因子Ⅷ的制备方法包括如下步骤：

S311.将所述步骤S3得到的上清液加入聚山梨酯80和磷酸三丁酯，24℃~26℃孵育至少6h进行S/D灭活；

S312.将步骤S311得到的灭活后制品调制后，经阴离子交换介质层析，所述阴离子交换介质层析包括平衡液平衡、淋洗液淋洗、洗脱液洗脱，收集的洗脱液经超滤透析后，除菌过滤即为原液；原液经稀释、配制、分装、冻干、干热灭活得到凝血因子Ⅷ成品；

所述人纤维蛋白原和纤溶酶原的制备方法包括如下步骤：

S321.将所述步骤S3得到的PEG沉淀溶解后，离心、过滤，加入聚山梨酯80和磷酸三丁酯，24℃~26℃孵育至少6h进行S/D灭活；

S322.将灭活后的制品通过超滤透析或者沉淀再溶解的方式使制品中氨丁三醇浓度达到0.01～0.1mol/L，pH值到达8.50～9.50，电导率达到0.1～2ms/cm；

S323.将步骤S322得到的制品澄清过滤后，使用阴离子凝胶进行层析纯化；上样前依次用0.5mol/L氢氧化钠溶液、注射用水、平衡液处理层析介质；层析上样线性速度为80～120cm/h，载量不高于100g蛋白/L凝胶；上样结束后用淋洗液顶洗凝胶2～6柱体积，流穿液和顶洗出的缓冲液废弃处理，用洗脱液进行洗脱获得洗脱制品Ⅰ；

S324.用分子量为100KD的聚醚砜超滤膜包超滤浓缩步骤S323的洗脱制品Ⅰ，3～5倍透析液等体积超滤透析，除菌过滤后即为原液，原液经稀释、配制、分装、冻干、干热灭活得到人纤维蛋白原成品；

S325.步骤S323洗脱液洗脱结束后，用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱并收集洗脱制品Ⅱ，即为纤溶酶原初提品；纤溶酶原初提品经ECH-lysine sepharose 4 fast flow凝胶亲和层析后，分别用0.05mol/L磷酸盐、0.1mol/L氯化钠、0.05～0.5mol/L盐酸赖氨酸溶液洗脱；用分子量为30KD的聚醚砜超滤膜包超滤浓缩得到的洗脱制品，3～5倍透析液等体积超滤透析，除菌过滤后即为原液；原液经稀释、配制、分装、冻干、干热灭活得到人纤溶酶原成品。

2.根据权利要求1所述的一种同时制备人纤维蛋白原、凝血因子Ⅷ和纤溶酶原的方法，其特征在于，所述步骤S2中，洗涤时氨丁三醇浓度为0.01~0.1mol/L，pH6.50～7.50，洗涤温度为0～4℃。

3.根据权利要求1所述的一种同时制备人纤维蛋白原、凝血因子Ⅷ和纤溶酶原的方法，其特征在于，所述步骤S312中，灭活后制品调制方法为调整所述灭活后制品的氯化钠浓度至0.10~0.20mol/L；阴离子交换层析介质为Toyo Pearl DEAE-650M。

4.根据权利要求1所述的一种同时制备人纤维蛋白原、凝血因子Ⅷ和纤溶酶原的方法，其特征在于，所述步骤S312中，平衡液组分为0.01～0.1mol/L的氨丁三醇，0.10～0.20mol/L的氯化钠，pH值为6.50～7.50；淋洗液组分为0.01～0.1mol/L的氨丁三醇，0.10～0.20mol/L的氯化钠，pH值为6.50～7.50；洗脱液组分为0.01～0.1mol/L的组氨酸，0.15～0.25mol/L的氯化钠，pH值为6.00～7.00。