[发明专利]一种沙漠蛋白核小球藻异养-稀释-光诱导培养方法

说明书

本发明涉及一种沙漠蛋白核小球藻异养‑稀释‑光诱导培养方法。本发明将异养方式与自养方式的结合方式，大大提高沙漠蛋白核小球藻的生物量和蛋白质含量，达到高效生产大量高蛋白质含量的沙漠蛋白核小球藻的目的，不仅可在短时间内获得较高浓度的藻细胞生物量，还可诱导蛋白核小球藻内蛋白质、叶绿素等物质的积累，改善蛋白核小球藻品质，提高蛋白核小球藻的综合利用价值。此外，该方法具有操作简便、实用性强、易实现连续生产等特点，非常有利于大规模的推广和应用，以快速高效地获得大量的高含量蛋白质的沙漠蛋白核小球藻藻粉，为高品质沙漠蛋白核小球藻藻粉的生产提供技术支撑，满足工业生产的需求。

技术领域

本发明涉及微藻养殖技术领域，具体为一种沙漠蛋白核小球藻异养-稀释-光诱导培养方法。

背景技术

小球藻(chlorella sp.)是一种普生性单细胞绿藻，属于绿藻门，绿藻纲，卵囊藻科，小球藻属。我国常见的小球藻种类有蛋白核小球藻、椭圆小球藻、普通小球藻等。小球藻富含蛋白质、不饱和脂肪酸(亚油酸、亚麻酸、DHA、EPA等)、类胡萝卜素、虾青素和多种维生素，广泛应用于功能食品、饲料、化妆品和医药等领域。

现有的蛋白核小球藻藻粉生产方法主要包括开放式自养培养、密闭式异养培养、混合培养。开放式自养培养，易污染，光照、温度等培养条件易受天气影响，藻细胞浓度低，采收成本较高，密闭式异养培养一般利用葡萄糖作为碳源，采用高耗能的硝态氮如硝酸钠作为氮源，虽能够获得较为理想的藻细胞浓度，但由于培养过程一直处于黑暗条件下，后期收获的藻粉蛋白质和叶绿素等含量都较低，使得藻细胞的品质和多种生物活性功能明显不足，且培养过程中多用盐酸调节pH值，容易对发酵设备造成一定程度的损害。

塔克拉玛干沙漠绿藻作为极端环境微藻，在几十万年的进化中，其生物学特性、生理生化组分等与绿藻存在一定差异。培养条件和培养技术较为缺乏，为了解决，沙漠蛋白核小球藻自养培养生产周期长，生物量低，异养培养藻粉蛋白含量低等问题，本发明提供了一种适合沙漠蛋白核小球藻异养—稀释—光诱导培养方法，实现在短时间内获得较高品质的沙漠蛋白核小球藻。

发明内容

鉴于现有技术中所存在的问题，本发明公开了一种沙漠蛋白核小球藻异养-稀释-光诱导培养方法，包括步骤如下：

步骤一、藻种活化：从藻种资源库取出平板划线的蛋白核小球藻，在无菌工作台中挑取单个藻株，划线于固体培养基中，置于光照培养箱中培养，培养温度28℃，光照5000lux培养15天，得到活化藻种；

步骤二、一级种子液制备：从活化藻种中挑取3-5环藻种，接种到装有50mL培养基的100mL三角瓶中，在温度28℃、光照5000lux，50r/min的振荡培养箱中培养至对数生长期10⁸个/mL，得到一级种子液；

步骤三、二级种子液制备：将一级种子液以10％(v/v)接种量接种于装有200mL培养基的500mL三角瓶中，在温度28℃、光照5000lux，50r/min的振荡培养箱中培养48～72小时，得到二级种子液；

步骤四、三级种子液制备：将二级种子液以10％(v/v)接种量接种于装有500mL培养基的1000mL三角瓶中，在温度28℃、光照5000lux，50r/min的振荡培养箱中培养48～72小时，得到三级种子液；

步骤五、异养培养：将三级种子液作为发酵培养的种子液，按照15％的接种量接种于发酵罐中培养，发酵罐培养温度为28℃，溶氧为25％，pH为7，发酵罐转速50r/min，培养72小时后，每天取料2000mL，补充新鲜培养液2000mL，保持半连续培养体系的稳定；

步骤六、稀释-光诱导培养：在步骤五的培养过程中，每隔24小时，取样检测发酵液中蛋白核小球藻的细胞干重，初始藻细胞浓度为干重状态2.12-4.24g/L，当连续两天检测生物量无显著差异时，停止培养，藻细胞浓度为干重状态150-200g/L；将发酵罐中培养液稀释，转入60L柱状光生物反应器中连续培养，培养条件为28℃，光照10000lux，空气通气量为1L/min，每天取样检测，连续2天检测中，蛋白质含量无显著差异时，培养结束。