[发明专利]一种简化的农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化方法

说明书

本发明涉及一种简化的农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化方法，属于农业生物技术领域。斜切胚芽鞘下部与伸长区的分界位置获得玉米茎尖转化受体；将玉米茎尖转化受体在农杆菌液OD₆₀₀为0.65，真空渗透压为0.050MPa，真空处理时间为3min，乙酰丁香酮最终浓度为150μM的条件下进行侵染，培养3周，经除草剂Basta初筛获得抗性苗或者经PCR检测证明外源基因已转入玉米基因组DNA中。经PCR检测T₁代转化植株，证明外源基因可遗传至后代。本发明首次针对玉米建立简化的不依赖于组织培养的农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化体系，对玉米遗传转化技术具有重要意义，可以有效推进玉米分子育种进程。

一、技术领域

本发明涉及一种简化的农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化的方法，属于农业生物技术领域。

二、背景技术

玉米是世界三大主粮之一，同时也是重要的工业原料和饲料来源。随着我国经济不断发展及人口大规模化和城市化，肉类和乳制品消费需求不断增加，以及玉米乙醇燃料产业的蓬勃发展，玉米的种植面积及产量逐渐增加。传统的玉米育种主要依赖于玉米杂交育种，但是传统杂交育种过程缓慢，同时我国玉米种质资源狭窄等突出问题也限制我国玉米育种。随着转基因技术的发展，通过转基因技术提高玉米产量和品质成为玉米育种的重要途径。

自1975年以来，通过从玉米幼胚、未成熟花序、雌雄幼穗等外植体诱导诱导成愈伤组织，再经过植物组织培养过程，诱导成植株。但是由于玉米遗传背景复杂、愈伤诱导率低、基因组较大，再生植株成活率低等问题，玉米遗传转化仍然受到许多因素的限制。目前在玉米遗传转化中主要采用幼胚作为外植体的转化方法。玉米幼胚通过植物组织培养诱导愈伤组织，进而再生分化出植株，但幼胚作为受体材料的缺点在于受体材料的获取受季节限制严重，幼胚诱导愈伤组织的过程受基因型影响较大，并且在组织培养过程中存在着无菌操作环境要求严格、操作时间长、工作量大、植物材料易出现褐化、玻璃化等问题。因此，建立一种不依赖于植物组织培养的玉米遗传转化的方法对加快玉米分子育种具有十分重要的意义。

玉米茎尖的取材方便，基因型的依赖性小，并且玉米茎尖分生组织具有高度的分裂和分化能力、高效再生潜力等特点，因此可以做为遗传转化的材料。1996年Zhong等通过基因枪转化法对玉米的茎尖分生组织进行轰击，诱导丛生芽后得到了遗传转化玉米植株，证明玉米茎尖分生组织可以作为玉米遗传转化的受体材料。Zhang等对玉米自交系B73进行茎尖组织培养，并通过基因枪转化法实现了玉米茎尖的转化。但是基因枪的转化频率与受体种类、微弹大小、轰击压力、制止盘与金颗粒的距离、受体预处理、受体轰击后培养有直接关系，由于影响因素较多，因此转化效果不稳定，成功率低，实际运用中难以获得转化玉米植株。Sidorov等采用玉米茎尖分生组织诱导胚型愈伤组织，再经农杆菌侵染方法获得了转基因植株。张举仁等采用农杆菌侵染茎尖分生组织，并经过组织培养方法来获得转基因植株。虽然以上两种方法采用农杆菌侵染玉米茎尖分生组织，然而都需要经过时间漫长的组织培养过程，存在着对无菌操作环境要求严格、工作量大、获得转基因植株时间长等问题。因此建立一种操作简单不依赖于组织培养的农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化方法对玉米遗传转化技术具有重要意义，从而有效推进玉米分子育种进程。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是针对玉米转化中存在着基因型依赖性强、转化受体季节时间限制高、组织培养过程中出现的存在着对无菌操作环境要求严格、工作量大、获得转基因植株时间长等问题，专门对玉米茎尖遗传转化进行了系统深入研究，建立一种简化的不依赖于组织培养的农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化方法，为玉米遗传转化技术和推进玉米分子育种进程奠定基础。

技术方案

一种简化的农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化的方法，其特征在于，斜切玉米胚芽鞘下部与伸长区的分界位置，获得玉米茎尖转化受体。具体步骤包括：

1)玉米茎尖转化受体的准备