[发明专利]一种真菌孢子损伤鉴定的方法

权利要求书

1.一种真菌孢子损伤鉴定的方法，该方法包括真菌孢子细胞膜损伤鉴定，其特征在于，还包括真菌孢子DNA损伤鉴定；

所述的真菌孢子细胞膜损伤鉴定具体为，使用SYBR Green I荧光染料对真菌孢子进行两次染色，在SYBR Green I染色时加入EDTA，再使用碘化丙啶对真菌孢子进行染色；使用消毒剂处理真菌孢子后，加入硫代硫酸钠淬灭消毒剂；采用流式细胞仪用于定量分析真菌孢子细胞膜的损伤程度；

所述的真菌孢子DNA损伤鉴定具体为，使用SYBR Green I荧光染料对真菌孢子进行两次染色，在SYBR Green I染色时加入EDTA；使用消毒剂处理真菌孢子后，加入硫代硫酸钠淬灭消毒剂；采用流式细胞仪用于定量分析真菌孢子DNA的损伤程度。

2.如权利要求1所述的真菌孢子损伤鉴定的方法，其特征在于，所述的真菌为青霉或木霉。

3.如权利要求1所述的真菌孢子损伤鉴定的方法，其特征在于，所述的真菌孢子细胞膜损伤鉴定包括步骤一至步骤四；所述的真菌孢子DNA损伤鉴定包括步骤一、步骤二和步骤五；该方法具体包括如下步骤：

步骤一，制备初染孢子悬液：

步骤1.1，制备未染色的孢子悬液：

真菌孢子培养三周后，用灭菌后的磷酸盐缓冲液打在菌落表面，然后轻轻刮取真菌孢子并将真菌孢子悬浮在磷酸盐缓冲液中，得到粗悬液；将粗悬液进行过滤和离心清洗后，得到沉淀A，用磷酸盐缓冲液将沉淀A重悬后得到孢子悬液；

步骤1.2，SYBR Green I初步染色：

在步骤1.1中所述的孢子悬液中加入SYBR Green I荧光染料和EDTA母液，震荡混匀后得到混合物B，所述的EDTA在混合物B中的终浓度为10μM～60μM；将混合物B在37℃的温度下，避光染色20min，得到初染孢子悬液；

步骤二，制备复染孢子悬液：

步骤2.1，真菌孢子离心重悬浮：

将步骤1.2中所述的初染孢子悬液，离心清洗后，得到沉淀C，将沉淀C用磷酸盐缓冲液重悬后得到混合物D；

步骤2.2，设置实验组和对照组，对实验组进行消毒剂处理：

步骤2.2.1，实验组处理：

在步骤2.1中所述的混合物D中加入消毒剂氯胺，所述的消毒剂氯胺在混合物D中的终浓度为3mg/L，在室温静置处理20min～120min后，加入硫代硫酸钠，得到混合物E1；所述的硫代硫酸钠在混合物E1中的终浓度为0.05M；

步骤2.2.2，对照组处理：

将步骤2.1中所述的混合物D，在室温静置20min～120min后，加入硫代硫酸钠，得到混合物E0；所述的硫代硫酸钠在混合物E0中的终浓度为0.05M；

步骤2.3，SYBR Green I二次染色：

在步骤2.2中所述的混合物E1和混合物E0中，分别加入SYBR Green I荧光染料和EDTA母液，震荡混匀后分别得到混合物F1和混合物F0，所述的EDTA在混合物F1和混合物F0中的终浓度均为10μM～60μM；将混合物F1和混合物F0在37℃的温度下，避光染色20min后，得到实验组复染孢子悬液和对照组复染孢子悬液；

步骤三，制备碘化丙啶染色孢子悬液：

在步骤2.3中所述的实验组复染孢子悬液和对照组复染孢子悬液中，分别加入碘化丙啶染液，震荡混匀后分别得到混合物G1和混合物G0，所述的碘化丙啶在混合物G1和混合物G0中的终浓度均为6μM；将混合物G1和混合物G0在37℃的温度下，避光染色20min，得到实验组碘化丙啶染色孢子悬液和对照组碘化丙啶染色孢子悬液；

步骤四，定量分析真菌孢子细胞膜损伤：

采用流式细胞仪，对步骤三所述的实验组碘化丙啶染色孢子悬液和对照组碘化丙啶染色孢子悬液分别进行检测；流式细胞仪的设定参数具体为：发射波长488nm，激发波长630nm，进样体积为20μL，进样速度为33μL/min，进样总颗粒小于500个/s；检测完成后，经过数据处理获得真菌孢子细胞膜损伤率；

步骤五，定量分析真菌孢子DNA损伤：

采用流式细胞仪，对步骤2.3中所述的实验组复染孢子悬液和对照组复染孢子悬液分别进行检测；流式细胞仪的设定参数具体为：发射波长488nm，激发波长570nm，进样体积为20μL，进样速度为33μL/min，进样总颗粒小于500个/s；检测完成后，经过数据处理得到真菌孢子DNA损伤率。