[发明专利]基于三维照明调制的双物镜单分子荧光显微成像方法和装置

说明书

本发明公开一种基于三维照明调制的双物镜单分子荧光显微成像装置，包括激发光路模块和成像光路模块，激发光路模块包括依次布置的：激光器，发出激光光束；分束与扫描系统，用于将光束分为独立选通或截止的四束线偏振光，并进行成像位置扫描及改变光程差；双物镜系统，用于将激发光分成对称的两组在像面上干涉并收集荧光；成像光路模块包括依次布置的：相位调制系统，用于将两路荧光按照s和p偏振分为四束干涉光且引入指定的相位延迟；相机，用于收集荧光强度信号；计算机，用于控制分束与扫描系统和相机，改变干涉条纹相位、方向和拍照，并处理采集的数据，得到超分辨图像。本发明还公开一种基于三维照明调制的双物镜单分子荧光显微成像方法。

技术领域

本发明属于光学超分辨荧光显微成像领域，特别涉及到一种基于三维照明调制的双物镜单分子荧光显微成像方法和装置。

背景技术

在生物医学成像和生命科学研究领域，超分辨荧光成像一直是研究的重点，但受限于衍射极限，其光学分辨率仅为荧光的半波长，使得细胞内更精细的结构无法分辨。因此，近几十年来，科学家们致力于对荧光显微镜分辨率的提升，近年来主流的两类超分辨荧光显微技术是单分子定位技术和结构光照明技术。

单分子定位技术利用特殊荧光染料的稀疏发光特性，每次仅令部分单分子发射荧光，通过拍摄大量稀疏发光单分子图片合成重构出一张超分辨图像。如公开号为CN109407293A的专利申请提供的单分子定位装置，由于单张图片发光单分子分布稀疏，可以利用拟合定位的方法将分辨率提升至10nm量级，然后利用多帧图像的叠加实现超分辨图像重构。这种方法要求荧光标记密度较高，需要特殊染料，而且成像速度慢。

结构光照明技术通过调制照明光激发荧光样品，在傅里叶域对图像频谱进行处理，将普通显微镜无法观测到的高频分量移动到低频范围内，利用多帧图像解算出扩大的样品频谱从而提高图像分辨率。如公开号为CN107907981A的专利申请提供的三维结构光照明超分辨显微成像装置，结构光照明显微镜需要获取的图像数量较少，成像速度高，适用于实时活体细胞成像；所需荧光标记密度较低，无需特异荧光染料，但受限于原理最多只能提升一倍分辨率，大约在100nm量级。

发明内容

本发明提供了一种基于三维照明的双物镜单分子荧光显微成像方法和装置。本装置将结构光照明技术与单分子荧光成像技术结合，并引入双物镜结构提升接收荧光的能力，使分辨率可以在单分子显微成像技术的基础上提升3倍以上，实现优于5nm的超高分辨率，对亚细胞结构的观测具有重要意义。

本发明本质上仍是一种单分子定位超分辨技术，提升分辨率的核心在于引入调制照明条纹，无需在频域计算，只需通过发光的单个分子能量在条纹移相过程中的强度变化计算出该分子在条纹中的相对位置从而得到相比传统单分子拟合定位法更高的定位精度，实现分辨率的进一步提升。

本发明采用的具体技术方案如下：

一种基于三维照明调制的双物镜单分子荧光显微成像装置，包括激发光路模块和成像光路模块；

所述激发光路模块包括依次布置的：

激光器，发出激光光束用于激发荧光；

分束与扫描系统，用于将激光光束分为独立选通或截止的四束线偏振光，并进行成像位置扫描及改变光程差；

双物镜系统，用于将激发光分成对称的两组在像面上干涉并收集荧光；

所述的成像光路模块包括依次布置的：

相位调制系统，用于将两路荧光按照s和p偏振分为四束干涉光且引入指定的相位延迟；

相机，用于收集所述的荧光强度信号；

计算机，用于控制所述的分束与扫描系统和相机，以精确的时序分别改变干涉条纹相位、方向和拍照，并处理采集的数据，得到超分辨图像。

优选的，所述分束与扫描系统包括：