[发明专利]原位杂交探针复合体、其制备方法及应用

说明书

本发明提供了一种原位杂交探针复合体、其制备方法及应用。本发明揭示了一种优化的原位杂交探针复合体，由杂交探针1和杂交探针2组成；每个探针包括探针结合区、间臂连接区和互补配对区三个部分，并在5’和3’端进行可检测标记物的标记。杂交探针1和杂交探针2通过互补配对区形成探针复合体，该复合体可以和两组目标基因片段结合，并且携带4个可检测标记物。本发明的技术方案既能够显著增加阳性样品的染色强度，又可以有效降低原位杂交染色的背景信号，从而提高样本检测的准确性。

技术领域

本发明属于基因检测领域；更具体地，本发明涉及一种制备用于免疫组织化学检测的原位杂交探针复合体、其制备方法及应用。

背景技术

原位杂交是采用特定标记的已知核酸序列为探针，与细胞或组织切片上的核酸序列发生杂交反应，对核酸进行精确定位的方法。因此可以借助于原位杂交，得到细胞中特定核酸的位置及丰度信息。该方法将与待测核酸分子序列互补的核酸探针溶解到杂交缓冲液中，并滴加到经蛋白酶消化的组织切片上，使核酸探针与目标核酸分子结合。在核酸探针上附加有检测用的标记物(如荧光标记、地高辛标记等)，用适当的方法对标记物进行检测，最后在显微镜下观察结果。

对原位杂交探针进行荧光标记的操作相对复杂，荧光标记探针的稳定性差，容易发生降解，导致探针有效期较短，且需要使用相对昂贵的荧光显微镜来观察结果。这些不利因素限制了荧光原位杂交探针在临床上的推广应用。

一般情况下，可以通过体外转录或化学合成的方式制备用于核酸原位杂交的探针。采用体外转录方式制备杂交探针时，可以将Dig-UTP混入转录体系，从而在探针上附加Dig标记。或者先合成寡核苷酸引物链，再通过化学修饰将Dig标记到引物上。采用Dig标记的原位杂交探针，其长度范围多为30-200bp。对于双螺旋的核酸分子，每1个碱基对的长度约为0.3-0.4nm，一个包含30个碱基的核酸探针与目标核酸结合后，总长度大约为10nm。而一个IgG抗体分子的直径也在10nm左右。在原位杂交反应过程中，组织细胞被固定在玻璃片的表面，一个相对较短的杂交探针(比如30bp)与细胞中的目标核酸片段结合后，所携带的地高辛标记与抗地高辛抗体的结合会受到空间位阻的限制。所以，对于短片段的杂交探针，即使增加探针上Dig标记的数量，也不能捕获到更多的抗地高辛抗体，不能增加阳性显色的信号强度。如果使用较长的杂交探针(比如长100～200bp，且携带多个Dig标记)，单个杂交分子理论上可以捕获多个抗地高辛抗体，从而增加显色信号强度。但较长的杂交探针在温和的杂交条件下(比如37～50℃温育)，容易发生杂交探针的非特异性结合，导致显色的背景信号加深，并影响染色结果的判断。

鉴于此，本领域还需要进一步研究优化核酸原位杂交的探针试剂以及相应的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供用于免疫组织化学检测的原位杂交探针复合体及其制备方法。

在本发明的第一方面，提供一种制备原位杂交探针复合体的方法，包括：

(1)制备杂交探针1，其包括通过间臂连接区连接的探针结合区1和互补配对区1，在5’和3’端标记可检测标记物；

(2)制备杂交探针2，其包括通过间臂连接区连接的探针结合区2和互补配对区2，在5’和3’端标记可检测标记物；

其中，所述探针结合区1与所述探针结合区2分别与目标核酸的两组区段互补；所述互补配对区1和互补配对区2互补形成探针复合体，从而一个复合体能结合两组目标核酸区段、并由四组可检测标记物进行信号报告。

在本发明的另一方面，提供一种原位杂交探针复合体，包括：

(1)杂交探针1，其包括通过间臂连接区连接的探针结合区1和互补配对区1，其5’和3’端标记有可检测标记物；

(2)杂交探针2，其包括通过间臂连接区连接的探针结合区2和互补配对区2，其5’和3’端标记有可检测标记物；