[发明专利]一种糖胺聚糖的分离纯化方法及硫酸化寡糖的制备方法

说明书

本发明公开了一种糖胺聚糖的分离纯化方法，该方法采用分步洗脱的方法，将样品溶于水后上样于高效离子交换材料，分别使用水、低浓度氯化钠溶液、高浓度氯化钠水溶液依次洗脱，具有样品用量少，分析时间短，操作简单的特点。本发明还提供一种硫酸化寡糖的制备方法，该方法使用过氧化氢为反应物，以抗坏血酸为催化剂，在一定温度下进行反应降解硫酸化多糖产生寡糖，具有微量高效、条件易控制、无污染的特点。

技术领域

本发明涉及海洋硫酸化多糖提取、快速分离纯化以及结构解析领域，特别是涉及使用酶解提取、QFF（Q SEPHAROSE Fast Flow 强阴离子交换树脂快速分离纯化、过氧化氢降解方法。

背景技术

由于海洋特别是深海特殊的高压、温差小、溶氧量低、光线有限以及离子种类丰富的环境，海洋生物拥有相较于陆地生物更丰富的活性物质，海洋生物资源包括多糖、蛋白质以及其他活性物质的进一步开发一直是海洋发展的热点问题。近年来，海洋多糖中的硫酸化多糖相比其他多糖具有更好的溶解性、更高的硫酸盐含量和电荷密度被发现具有多种生物活性，如抗凝血、抗炎、抗肿瘤、免疫调节等，不仅如此，相比于陆地硫酸化多糖，海洋硫酸多糖受病毒或者朊病毒的污染程度低，被认为是更加安全的多糖，在生物和医药领域引起了广泛关注。结构决定功能，因此，对海洋硫酸化多糖的结构解析成为研究其活性的基础。

然而，海洋硫酸化多糖的存在形式多样，在海洋生物体内通常通过具有不寻常但规则重复单元的糖肽共价键与蛋白质相连，并且，海洋水生生物体内，蛋白质含量高，脂肪含量低，多糖在其中的结合和存在形态以及聚糖结构也不同于陆地生物多糖。

想要得到纯度比较高的多糖，还必须对粗多糖进行分离纯化，分离纯化主要的目的是得到组成较为单一的多糖组成。分离纯化主要包括两个方面，去除杂质以进行多糖的富集以及具有不同结构和构象特征的多糖级分分离。富集多糖就是尽可能地去除粗多糖中的蛋白质、色素、淀粉和一些小分子物质等。去除粗多糖中蛋白质的应用最广泛的方法是Sevag法，但实验表明，该方法脱蛋白效率低下，往往需要反复几次才能将蛋白脱除干净，此外，该方法使用有机溶剂容易造成环境污染，并且容易造成多糖损失；目前主要采用活性炭吸附去除粗多糖中的色素，而这个方法会出现纯化效率低下以及可能会出现炭残留等问题。与去除杂质相比，多糖的级分分离是更为精确的操作，由于不同的级分混合容易影响对其结构和生物活性的深入研究，通常根据多糖的分子量分布、电荷性质、亲和性质等的差异进行分级操作，其中，柱层析技术是应用最广泛的级分分离技术，针对海洋硫酸化多糖，目前应用最广泛的分级方法是使用阴离子交换层析柱，上样后使用不同浓度的盐溶液进行5-6次洗脱，再使用苯酚-硫酸比色法进行分析以合并相同组分，可以在一定程度上分离粗多糖中的不同级分，但是此方法的弊端在于：每个浓度的洗脱液都要分管收集并进行分析，此外，针对不同样品，需要分别进行预实验以确定盐溶液梯度，实验步骤过于繁琐。

由于天然多糖的较高分子量和多分散性，对完整的天然多糖结构解析十分困难，因此在分析之前要使用可控的方法降低多糖的分子量并且简化其低聚混合物，天然的硫酸化多糖是一种结构复杂的高分子量聚合物，只有少数硫酸化多糖比如硫酸软骨素、肝素等，有特定的酶可以将它们降解，但是多糖结构一旦发生改变，原有的酶就失去了对修饰后的多糖的特异性作用，除此之外，常用的多糖降解方法还有化学法，包括酸或碱降解、氧化剂降解、自由基降解等，其中，酸或碱降解除了条件难控制之外，还可能造成多糖原始结构的破坏，最常用的硫酸化多糖降解方法是自由基降解，近年来，大多采用化学试剂或辐射产生的活性氧来降解硫酸化多糖，基于芬顿体系的自由基降解是近年来常用的多糖降解方法，不同于酶解的高度特异性，自由基降解可以用于降解所有种类的多糖，就算硫酸化多糖的修饰增加，结构改变也可以将其降解，此方法通常使用金属离子或者其他物质作为催化剂，过氧化氢分解产生活性氧，可以快速攻击聚糖链并捕获与碳相连接的氢形成羟烷基自由基，最终将碳氧键转化成醛、酮或者酸。硫酸化多糖的自由基降解因能使其保持其原有的结构信息，不引起分支断裂或硫酸基团的损失，重现性好，价格便宜而得到广泛应用，其中，最常用的催化剂包括CU²⁺和Fe²⁺,但这两种金属离子在反应之后需要采用一定的方法脱除，因此使反应时间延长，降低了分析效率。