[发明专利]一种全血糖化血红蛋白含量液相色谱串联质谱定量检测方法

说明书

一种全血糖化血红蛋白含量液相色谱串联质谱定量检测方法，通过全血样本离心分离获得血细胞，将血细胞制备为溶血液，并通过重组羧肽酶B水解作用，血红蛋白在β链N末端第二个氨基酸残基(His)处断开，得到糖基化HbAsubgt;1c/subgt;二肽和非糖基化HbAsubgt;0/subgt;二肽，这些二肽以HPLC‑MS/MS进行分离定量，以HbA1c二肽标准品及HbAsubgt;0/subgt;二肽标准品混合物作为校准品，进行分离定量，得到标准曲线，根据HbA1c二肽和HbAsubgt;0/subgt;二肽的峰面积计算出其含量。该检测方法所需样本量少、灵敏度高、特异性强、重现性好、分析时间短，可为临床诊断提供可靠依据。

技术领域

本发明涉及医学检验领域，具体涉及一种全血糖化血红蛋白含量液相色谱串联质谱定量检测方法。

背景技术

糖化血红蛋白(Hemoglobin A_1c；HbA_1c)是人体血液中葡萄糖与血红蛋白β链N末端缬氨酸残基以共价键结合的稳定的化合物，全称为：血红蛋白β链(血液)-N-(1-脱氧果糖-1-基)血红蛋白β链。HbA_1C由葡萄糖的游离醛基与HbA的β链N末端缬氨酸的氨基经非酶促结合反应，先形成不稳定的Schiff碱(醛亚胺)，然后经过Amadori(葡糖胺)重排，最后形成稳定的酮胺化合物，其含量主要取决于血糖浓度及血糖与血红蛋白的接触时间，可以反映测定前120d的平均血糖水平。目前，临床定量测定及应用的是HbA_1C结果^[1]。

国际临床化学与医学实验室联盟(International Federation of ClinicalChemistry and Laboratory Medicine，IFCC)：测定HbA_1C国际公认的参考方法为IFCC推荐的高效液相色谱串联电喷雾电离一级质谱或高效液相色谱串联毛细管电泳，两种方法结果一致。测定方法主要分为三步：首先制备溶血液；然后采用蛋白内切酶Glu-C将溶血液酶解消化，得到糖基化和非糖基化的β链N末端六肽(HbA_1c六肽，HbA₀六肽)；最后采用高效液相色谱串联电喷雾电离一级质谱或高效液相色谱串联毛细管电泳对HbA_1c六肽和HbA₀六肽进行定量分析。以标准物质IRMM/IFCC-466HbA_1c和IRMM/IFCC-467HbA₀的混合物作为校准品，同步进行酶解，分析，得到标准曲线，根据HbA_1c六肽，HbA₀六肽的峰面积比计算得出HbA_1c的含量^[1]。经过Glu-C内切酶的水解作用，血红蛋白在β链N末端第6个氨酸残基(Glu)处断开，得到糖基化HbA_1C六肽和非糖基化HbA₀六肽，即：C₄H₉O₄-CO-CH₂-NH-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-COOH和NH₂-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-COOH^[2]。该参考方法具有准确度高，重复性好等优点，但前处理操作复杂，耗时长且测定成本高昂。

参考文献：

[1]中华人民共和国卫生行业标准WS/T 461—2015

[2]王冬环等，柱前衍生高效液相色谱测定糖基化血红蛋白，中国实验诊断学，2015年12月底19卷底12期

发明内容